光学显微镜技术

光学显微镜（light microscope）简称光镜，是最早和最重要的研究细胞结构的工具。在细胞生物学中常用的光学显微镜有普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光共聚焦显微镜、微分干涉差显微镜、暗视野显微镜和超分辨光学显微镜等。

光学显微镜的光学部分主要由聚光镜、物镜和目镜三部分组成。评定显微镜成像能力的主要指标是它的分辨力，即可分辨的相邻两点的最小距离。能够区分的两点距离越小，显微镜的分辨力越高。普通光学显微镜可以观察到的细胞中最小的结构是线粒体，其大小约为0.5μm。一般将光学显微镜可以观察到的结构称为显微结构。由于普通光学显微镜以可见光为光源，不能直接观察到近乎无色透明的生物体的组织和细胞，而且大多数生物体系组织太厚，必须将待测样品的组织标本切成薄片并染色后置于显微镜下观察才可见。光镜可观察到的切片厚度一般为1～10μm。此外，固定后的组织细胞仍然很柔软，在切片前还需要用支持剂（蜡或树脂）进行包埋。光学显微镜技术应用广泛，但由于可见光波长的限制，分辨力不高，只能用于观察生物体组织和细胞的一般显微结构。

荧光显微镜（fluorescence microscope）是在传统光学显微镜的基础上发展起来的，其基本结构由光源装置、滤色系统（包括激发光的滤光片和阻断滤光片）和光学系统组成。荧光显微镜的光源装置采用高压汞灯，高压汞灯能发射强光，这种光通过激发光的滤光片后可以得到特定波长的激发光（如紫外光、蓝紫光）。一定波长的激发光通过标本后，可激发细胞内的荧光物质并发出一定颜色的荧光，然后再通过物镜和目镜的放大，以及置放在目镜中的阻断滤光片将激发光过滤掉，就可以观察到细胞中的荧光。不同的荧光物质需要不同的激发光波长，实际观察中应根据不同荧光物质选择合适的滤光片。

异硫氰酸荧光素（FITC）、Alexa568、Cy3、Cy5是常见的荧光染料，可以被一定波长的光激发后发出特定颜色的荧光。这些荧光染料常被用作标记抗体或其他特定类型的蛋白质，可以定性或定量分析能与标记的抗体结合的蛋白质的存在情况，还可以进一步对同一个细胞进行多种染色。此外，利用绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）及蓝色荧光蛋白（BFP）等荧光蛋白的基因转染活细胞，可实现对细胞的标记，在一定的情况下还可以实现对某些特定分子在细胞中活动行为的示踪。(https://www.daowen.com)

1932年，荷兰物理学家泽尼克（F.Zernike）发明了相差显微镜（phase contrast microscope），使观察活细胞成为可能，泽尼克也因此于1953年获得了诺贝尔物理学奖。活细胞是几乎无色透明的细胞，当光波通过活细胞时其波长和振幅的变化都不大，因此普通显微镜无法观察到活细胞。而相差显微镜的基本原理是利用光的衍射和干涉特性，在物镜后焦面上添加一个相板，并在聚光镜上增加环状光阑，由此把透过标本不同区域的光波的光程差（相位差）转变成振幅差（明暗差），从而提高细胞内各种结构之间的对比度，使细胞即使不染色也能清晰可见。用相差显微镜观察细胞时通常将光源放置在载物台上方，而物镜置于载物台下方，与一般光学显微镜相反，所以也将其称为倒置相差显微镜。相差显微镜特别适用于观察体外培养的活细胞的结构和活动，如果安装了成像记录设备，可以在相差显微镜下拍摄并记录体外培养的活细胞的生长和活动情况，如细胞分裂、细胞迁移运动等。

微分干涉差显微镜（differential interference microscope）是在相差显微镜原理的基础上发明的，其基本特点是能显示微细结构的三维投影构象，在其拍摄的图像中，细胞核、核仁及线粒体等较大的细胞器呈现出较强的凸起感。微分干涉显微镜常用于基因转移、核移植和转基因生物等生物工程的显微操作实验，也可用于细胞定量研究，如细胞的厚度和干重的测算等。

暗视野显微镜（dark-field microscope）主要用于无色透明标本（如活细胞）的观察，其聚光器的通光孔中央有一个圆形的遮光板，能将照明光源的中央部挡住，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而这种显微镜视野的背景是暗的，但被观察物体的边缘却是亮的，可以显示被观察物体的形状和变化。由于具有较高的分辨力，暗视野显微镜可以看到直径4 nm的小颗粒，这是普通显微镜分辨力的50倍。暗视野显微镜主要用于观察物体的轮廓，适合观察活细胞内的细胞核、线粒体以及液体介质中的细菌和真菌等。

自从1873年德国物理学家恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）提出光学显微镜存在分辨力极限（也称阿贝极限）后，人们一直认为光学显微镜的分辨力极限为200 nm，而融合了多种超分辨分子成像技术的超分辨显微成像（super-resolution microsopy imaging）则将光学显微镜的分辨力提高到30～50 nm的水平，使其成为生命科学研究的新工具。超分辨显微成像可以较为清楚地观察到完整的细胞器、单个DNA分子和蛋白质分子及其复合物的分子结构，还可以追踪特定蛋白质分子在细胞中的运动。