【实验原理】

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。在细胞培养过程中，为防止细胞株不断传代引起的细胞老化、支原体污染、染色体和基因的变异等现象的发生，可以通过冻存技术保存细胞，以便其在提供利用时，可快速繁殖。

在不加任何保护条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、p H值改变、蛋白质变性等，大的冰晶还会导致细胞膜、细胞器的损伤和破裂，最终导致细胞死亡。但如果在培养基中加入冰冻保护剂甘油或DMSO，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞受损。当前常使用的冰冻保护剂甘油或DMSO具有对细胞无毒、相对分子质量小、溶解度大、易穿透细胞等特点，使用的浓度范围在5%～15%之间，常用10%。

细胞冻存与复苏的一般原则是慢冻快融，这样可以较好地保证细胞的存活率。标准的冷冻速度开始为-1～-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速降温，冷冻速度可增至-5～-10℃/min，到-80℃之后可直接投入液氮内。液氮是最理想和适用的冷冻剂，它的沸点是-196℃，在此温度下，既无化学也无物理变化发生，对标本p H值无影响，汽化时不留沉淀，细胞在液氮中可长期保存。复苏细胞时须直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中快速解冻，以防止小冰晶转变为大冰晶而造成对细胞的损害（图15-8）。(https://www.daowen.com)

图15-8　细胞冻存和复苏的步骤示意图