【实验方法】

一、细胞冻存

1.选择形态良好、单层致密理想的细胞（对数生长期），在超净台中弃培养液，加入预温37℃、0.25%胰蛋白酶消化液，消化分散细胞。

2.弃消化液，加入新鲜培养液中止消化。

3.用吸管吹打分散细胞，移入灭菌的带盖离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清液。

4.加入适量冻存液（10%甘油、90%培养基或10%DMSO、90%培养基）制成细胞悬液，细胞密度为3×106个/mL左右。

5.将细胞悬液装入冻存管中，每管1～1.5 mL，旋紧管盖，并在管上标明细胞的名称和冻存日期，最后放入纱布袋中冻存。纱布袋的一端系以线绳，末端扎有小牌，注明细胞的名称和冻存日期，以便日后查找。

6.冻存管在4℃下存放30 min，转入-20℃下1.5～2 h，再转入-70℃下4～12 h后即可转移到液氮内。(https://www.daowen.com)

二、细胞复苏

1.从液氮罐中取出冻存管，立即置入40℃热水中，使细胞在1 min之内融化。

2.用75%乙醇擦拭消毒冻存管外壁，打开管塞，用吸管吸出悬液，注入离心管中，加入适量培养液，混匀后1 000 r/min离心5 min。

3.弃上清液，加入5 mL新鲜培养基，并用吸管轻轻吹打悬浮细胞。

4.将细胞悬液装入培养瓶中，37℃静止培养，取少量细胞悬液进行细胞计数，计算冻存细胞存活率。

5.待细胞贴壁后（4～6 h），换液再培养。

6.细胞长满后可进行传代培养。