1.6 挑战与展望
类器官技术的快速发展，为我们研究器官发育、再生与疾病提供了革命性的工具，使得很多生理和病理过程能在体外进行模拟和研究，但是类器官的构建与应用也面临很多挑战。第一，类器官构建的可重复性与标准化是类器官推广应用的基础，也恰恰是目前类器官研究领域面临的重大难题。第二，目前还缺乏对类器官形成机制的深入理解。第三，现有的类器官只能部分模拟组织在生理或病理状态下的功能与结构，构建结构和功能高度仿生的类器官将是类器官未来发展的一个重要方向。第四，构建多器官互作体系从而用于研究不同器官间的相互作用是未来令人兴奋的领域。
未来类器官的发展需要重视类器官构建的可重复性，并形成标准化操作流程。所谓的可重复性是指在相同的培养条件下，同一批次以及不同批次的类器官可以形成高度相似的表型特征，包括类器官的大小、形状、细胞组成和三维结构等。类器官的可重复性对于类器官的应用研究至关重要。对于一个模型系统，必须要能稳健地模拟组织/器官在生理或者病理状态下的表型，才能确切地反映其规律。例如，如果要利用类器官模拟组织与器官发育，那么类器官必须要能准确并可重复地模拟组织与器官发育的特征，我们才能进一步利用类器官模拟探究发育的分子与细胞机制。同样，利用类器官研究疾病发生发展的机制以及研究药物响应等，都要求其能稳定地反映疾病特征和指示药物响应的变化。利用类器官进行再生医学应用研究，除了要求类器官培养的可重复性，还需要类器官能规模化生产并且保证安全和有效。
生物工程技术是一种提高类器官构建可重复性的可能方法。在组织发育和再生的过程中，相关的形态生成素和物理因素的梯度会持续帮助建立组织极性和结构的多样性。同样，类器官能模拟组织发育和再生的原理，连续局部微环境的变化会快速诱导复杂细胞模式的出现，并进一步促进类器官结构形成。但是传统的类器官培养，其结构形成很随机，如小肠类器官通过对称性破缺随机形成隐窝结构［1］。这就需要通过对生物化学和生物物理信号进行有序的控制，从而引导类器官结构的形成。通过工程设计可以实现对类器官培养环境的控制，包括化学信号梯度，如生长因子、整合素结合蛋白等，以及生物物理参数，如几何形状、流体力学等［95］。例如，基于微流控和光化学技术可以实现对信号分子的有序控制，包括信号分子的浓度梯度、作用时间和空间分布等。Jianping Fu团队结合器官芯片设计和微流控技术实现了对BMP、Wnt以及TGF-β等信号通路的可控诱导，在体外实现了外胚层和羊膜发育过程中特定结构模式的诱导形成，还研究了不同信号的时空变化对PSCs向人类外胚层和羊膜发育的影响［96］。基于工程技术可以实现对组织几何形状的设计构建，从而引导类器官的生长。Matthias P.Lutolf团队利用组织工程技术仿生设计了小肠绒毛-隐窝结构，利用该设计的三维结构引导小肠干细胞的生长可以在体外形成小肠组织，并再现小肠绒毛-隐窝结构。该小肠组织能维持小肠的生理特征，如小肠的细胞组成，干细胞定位、组织再生能力，以及与微生物互作的能力等［97］。相比三维细胞外基质生长的小肠类器官结构的随机性，工程技术引导构建的小肠类器官结构更加均一，并且重复性好。该研究团队进一步开发了高通量制备工程设计引导的小肠类器官，并结合高通量细胞成像技术探究了小肠结构形成的调控机制，发现组织几何形状能促进小肠结构的形成［63］。这些开创性的工作提示巧妙的工程设计制造可以大大提高类器官构建的可重复性，实现类器官的可控诱导。
类器官构建面临的第二个挑战是缺乏对类器官形成机制的深入理解。许多类器官研究都集中在最终形成类器官结构和功能的解析上，缺乏对类器官形成过程的深入研究。在对类器官最终形成的结构与功能有了一定了解的基础上，是时候进一步探究类器官形成过程的分子与细胞机制。类器官形成过程本质上是模拟器官发育或再生的过程，因此，体内器官发育或者再生的相关知识可以帮助我们理解类器官形成的过程并对该过程进行进一步优化，反过来，类器官技术则提供了一个检验这些知识的机会。Richard Feynman曾说过一句名言：“凡我不能构建的，我就不理解。”［98］近年来，类器官与其他新技术的结合推动了对器官形成过程的研究。Prisca Liberali团队结合单细胞测序和活细胞成像技术研究了从单个细胞到形成小肠类器官的过程，并发现小肠类器官的形成是由转录调节因子YAP1瞬时激活所驱动的再生过程。小肠类器官形成过程中细胞与细胞间YAP1活性的差异会启动Notch和DLL1的激活，从而促进对称分裂打破并分化形成第一个Paneth细胞。Paneth细胞的出现会进一步形成干细胞壁龛，进而导致不对称结构隐窝和绒毛的形成［99］。为解析小肠类器官形成的机制，该研究团队进一步建立了基于图像分析的高通量筛选系统，并对将近2 800个小分子进行测试，建立了类器官表型与小分子靶点的关联图谱，发现视黄酸X受体（RXR）抑制剂能抑制小肠类器官的分化，促进小肠组织的再生［100］。这些工作为解析类器官形成的机制提供了很好的范例。
第三个挑战是类器官只能部分模拟组织和器官的功能与结构，缺少血管、神经和免疫系统等重要组成部分，这使得类器官只能部分模拟疾病特征。构建功能性血管网络一直以来是类器官领域以及组织工程领域试图解决的难题。构建较大体积的实体类器官受限于氧气和营养与代谢废物导致的组织坏死或结构功能损伤。关于类器官血管化构建，一个常用的方法是将类器官移植到体内，例如将肝芽和脑类器官移植到动物体内，类器官可以形成血管网络［27，101］。关于体外类器官血管化构建，研究者们也尝试了不同的构建策略。肾脏类器官中血管的形成是利用hiPSCs分化为肾脏细胞的过程中，自发分化出部分内皮细胞，而将分化后的肾脏类器官置于微流控装置中，在流通液体的刺激下，可以形成功能性血管网络［102］。脑类器官的研究中，功能性血管网络的形成可通过在细胞中过表达ETV2基因，诱导细胞发生趋内皮细胞的定向分化，再经过其与神经外胚层细胞的自组织后形成部分可贯通的血管网络［103］。(https://www.daowen.com)
类器官神经系统的引入也已有研究报道。例如，Mina Gouti团队诱导hiPSCs或者h ESCs分化成神经中胚层前体细胞（neuromesodermal progenitors，NMPs），并进一步将获得的NMPs进行3D培养并诱导形成人神经肌肉类器官。神经肌肉类器官包含由终末施旺细胞支持的功能性神经肌肉连接，它们收缩并形成类似中枢模式生成器的神经元电路。研究人员成功使用神经肌肉类器官模拟了重症肌无力的关键病理表型［104］。Sergiu P.Pasca团队获得了大脑皮层或后脑/脊髓类器官，并将它们与人类骨骼肌球体组装起来，以生成三维大脑皮层-运动类器官，融合后类器官可以维持形态与功能的完整长达10周之久［105］。
免疫微环境在疾病发生发展以及治疗，特别是癌症治疗方面也发挥着重要作用。研究者们正在积极构建含有免疫微环境的类器官模型。例如，Takanori Takebe团队利用hiPSCs和h ESCs在体外诱导分化获得含库普弗细胞的复杂肝脏类器官［85］。关于构建含有免疫微环境的肿瘤类器官，Calvin J.Kuo团队利用气-液培养的方式，构建了能保留肿瘤组织浸润免疫细胞的类器官，并且证明这些肿瘤类器官能模拟患者特异的抗PD1/PDL1免疫治疗的响应［106］。这些工作为进一步构建结构与功能更为复杂的类器官奠定了基础，积累了丰富的经验，未来科研工作者们需要继续为构建高度仿真的类器官而努力。
除了构建多细胞的类器官之外，建立多器官互作类器官模型也是未来类器官领域面临的挑战。为了模拟体内不同组织/器官之间的互作，研究者们进行了很多前期探索。其中一种方法是通过3D共培养方式实现不同类器官之间的直接接触，这种融合后的类器官称为“组装类器官（assembloid）”。相比单一的类器官，组装类器官可以建立不同类器官间的互作，从而形成新的结构与功能。例如上述描述的大脑皮层类器官与骨骼肌类器官形成的组装类器官可以建立神经-肌肉的连接，从而可以模拟谷氨酸释放或皮质球状体的光遗传刺激引发3D肌肉的强劲收缩的表型。采用相似的策略，Takanori Takebe团队建立了肝-胆-胰多器官互作的组装类器官［107］。近年来，类器官与器官芯片技术的结合为构建多器官互作体系提供了新的解决方案。通过器官芯片的设计，结合微流控技术可以实现多种类器官的共同培养［108］。除此之外，类胚胎构建技术的建立为构建多器官互作体系提供了另一种全新的思路，通过高度模拟体内发育过程可以建立人的类胚胎组织，从而可用于研究早期发育过程中多组织/器官的互相作用［109］。这些新的组织培养技术的建立为构建多器官互作体系提供很多新的思路，未来需要更多创新的培养技术建立，从而促进多器官互作体系构建的发展。
总之，类器官技术的兴起和快速发展无疑为生物学研究提供了重要的研究工具，由于类器官具有更贴近体内组织或器官的结构与功能，以及在体外易于操作和培养的特点，其在疾病模拟、药物筛选和再生医学等方面呈现出巨大的应用前景。当然，类器官构建将面临很多挑战，未来仍需在构建规范化类器官操作流程、深入理解类器官结构形成的机制，以及构建结构与功能高度仿真的类器官等方面努力。
（章正涛，李春，金悦，刘媛，陈晔光，惠利健）