2.4.3 模拟消化道疾病
1.遗传性疾病模型
随着基因编辑技术的不断发展和成熟（例如CRISPR-Cas9等），研究者能够在人PSCs和ASCs来源的类器官中引入或纠正致病基因突变，进而研究特定基因功能异常导致的遗传性疾病。
囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是类器官模拟人类遗传病最佳的例子。囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节因子CFTR基因缺陷引起，囊性纤维化跨膜传导调节因子是氯离子通道，其功能是向细胞外分泌氯离子。囊性纤维化跨膜传导调节因子基因缺陷（如ΔF608）导致囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白水平或定位异常，从而使外分泌氯离子减少，导致胞外黏液密度增加，最终导致包括胃肠道在内的多个器官功能异常。囊性纤维化患者的胃肠上皮细胞对囊性纤维化跨膜传导调节因子突变引起的c AMP增加的肿胀反应丧失。Johanna F.Dekkers等首次利用囊性纤维化患者的直肠组织建立类器官模型［78］，并发现其对forskolin（可促使c AMP合成）不响应，但使用囊性纤维化跨膜传导调节因子恢复化合物预孵育或通过CRISPR-Cas9纠正突变后可恢复类器官对forskolin的响应。基于这一发现，研究人员可以利用forskolin诱导类器官肿胀实验，对源自携带不同囊性纤维化跨膜传导调节因子突变的患者的类器官进行药物敏感性检测［79］。
发育不良是胃肿瘤中癌前病变的关键时期，Jimin Min等从Mist1-KRAS（G12D）小鼠模型中构建类器官［80］，发现KRAS激活可以控制细胞动力学和发育不良的进展。此外，Mohammed Soutto等发现TFF1敲除的小鼠胃类器官容易导致促炎的表型［81］，并伴随发育不良腺癌在内的一系列微损伤，同时发现TFF1通过阻碍IL-6-STAT3促炎致癌信号传导轴，进而预防胃肿瘤的发生。
Bigorgne和Schwerd等在极早发型炎症性肠病（VEO-IBD）患者中发现了TTC7A基因的双等位基因错义突变，导致了Rho A依赖性蛋白的过度激活，表现为肠上皮顶端基底细胞的极性丧失，而通过在类器官培养物中添加Rho A激酶抑制剂能够逆转这样的表型［82，83］。此外，STX3基因纯合截短突变引起的微绒毛包涵体病（MVIX）患者来源的类器官表现为刷状微绒毛的部分丢失和小泡的尖端下积聚［84］。类似地，Michael J.Workman等通过iPSCs来源的肠类器官成功模拟了PHOX2B突变导致的先天性巨结肠症［71］。
遗传性弥漫性胃癌（HDGC）是一种罕见的弥漫性胃癌，目前已经得知的致病原因是E-钙黏着蛋白的基因突变，但有超过一半的患者都无法明确其遗传突变的原因［85］。通过在类器官水平进行单基因编辑，可以帮助临床诊断，并且能在一定程度上改善患者愈后。
2.炎症模型
当食管黏膜上皮受到反复的慢性炎症侵扰时，原来的自我更新、增殖和分化的稳态受到破坏，当正常的复层鳞状上皮被柱状上皮取代后，便形成了类似于具有杯状细胞和黏液层的肠上皮样的巴雷特（Barrett）食管，这是引发食管癌的高危因素之一。Toshiro Sato等通过抑制Notch通路以促进分泌细胞谱系的分化［50］，从而建立了人巴雷特食管类器官，并且通过加入FGF10以维持其长期的传代培养。后续Ming Jiang等将表达KRT5和KRT7的P63＋基底细胞鉴定为潜在的巴雷特食管细胞来源［86］，并在类器官水平进行了功能验证。
此外，通过对正常食管类器官添加刺激的方式，可以定向诱导产生特定类型的炎症，极大丰富了食管炎症相关研究。如Toshiro Sato等通过对正常食管类器官中Notch信号通路的抑制，发现其并不影响类器官中细胞的增殖［50］，但表现出明显的基底细胞增生，而这种增生可能是分化受损的结构，因为这与嗜酸性食管炎患者的组织病理学结果是一致的，这是一种以食管上皮基底细胞增生和嗜酸性粒细胞增加为特征的疾病。并且，后续研究发现IL-13等因子也可以用于模拟嗜酸性食管炎的表型，并且能在类器官中检测到相关基因（SOX2、LOX、CCL26等）的过表达，并且通过TGF-β1、TNFα和IL-13刺激单细胞来源的小鼠食管类器官，可以观察到类器官中基底细胞的扩增［57，87］，这与人类食管炎活检标本中发现的反应性上皮变化和基底细胞增生的结果相一致。
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD），包括溃疡性结肠炎（ulucrative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn's disease，CD），是一种由遗传、环境等多因素共同作用导致的肠道慢性炎性疾病。溃疡性结肠炎仅局限于大肠黏膜表面，从直肠开始以连续的方式延伸到整个结肠，症状的严重程度取决于炎症所涉及的肠道区域；而克罗恩病则涉及小肠和大肠，常伴有阶段性或透壁性等严重的炎症反应［88］。炎症性肠病患者来源的类器官保留了原始组织的遗传和表观遗传特征，因此可用于研究炎症性肠病的致病机制。此外，对炎症性肠病患者上皮细胞类型的研究可以帮助确定疾病的亚型和表型，以进一步了解其行为和结果。
Isabella Dotti等鉴定了一组基因，包括Lyz、Cldn18和Hyal1等，发现它们在活动性UC患者的黏膜和衍生的类器官中上调；并且编码连接蛋白的基因，如ZO-1、Ocln和Ctnnb等，在CD患者的肠隐窝和衍生的类器官中的表达水平相似［89］。而Schwerd T.等构建了Nox1 p.n122h突变的炎症性肠病患者来源的结肠类器官［83］，与正常类器官相比，这些类器官表现出明显更少的组成性超氧化物的产生，这种缺陷可能有利于管腔微生物的隐窝定植。此外，上文提到，在VEO-IBD患者中发现了TTC7A基因的双等位基因错义突变，其导致Rho A依赖性蛋白的激活，通过改变细胞极化和增殖来调节细胞骨架结构，并且在类器官水平中得到证实［83］。除此之外，最近的一项研究表明，与非炎症性肠病儿童患者相比，炎症性肠病类器官中的DNA甲基化前体的变化与炎症性肠病发病机制密切相关［90］，并且在炎症性肠病患者中检测到杯状细胞数量减少、黏液分泌减少等现象。此外，还观察到炎症性肠病患者中潘氏细胞的组成性防御素表达减少［91］。这些结果都表明不同类型的肠上皮细胞在维持肠道内稳态中发挥着重要作用。
3.病原微生物感染模型
慢性幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）感染是胃癌的高危风险之一，胃类器官技术的发展使得人们对HP感染引发的胃疾病的发病机制有了更深入的了解。Sina Bartfeld等通过显微注射的方式将HP注射到人胃类器官的腔体中［92］，发现NF-κB信号通路显著上调，这是HP感染中最常观察到的现象。Kyle W.McCracken等通过相同的方式将HP注射到胃类器官的腔体中，发现细胞增殖和c-Met的磷酸化水平上升［24］，后者是HP病毒因子Cag A的靶点，表明HP转移到宿主细胞中并参与恶性转化的过程。后续研究同样发现HP感染导致患者和小鼠来源的胃类器官的细胞增殖水平上升，并以CD44依赖的方式增加上皮-间质转化过程［93］，一致的是，用CD44抑制剂预处理患者来源的类器官，能够抑制HP感染导致的上皮细胞过度增殖。此外，将从外周血单核细胞分离的人单核细胞衍生的树突状细胞与胃类器官进行共培养，发现HP感染导致树突状细胞产生多种趋化因子（包括CXCL2、CXCL16、CXCL17和CCL20），然后向胃上皮细胞募集［94］。并且在这样的共培养系统中加入细胞毒性T淋巴细胞，可观察到HP通过Shh（Sonic hedgehog）信号通路诱导PD-L1的表达从而进行免疫逃逸［95］。类似地，Pau Morey等通过小鼠和人的胃类器官证明表达Cgt的HP能够降低受感染的胃上皮细胞中的胆固醇水平［96］，从而阻断IFN-γ信号，进而使细菌逃避宿主的炎症反应。上述结果表明，胃类器官不仅能用于研究HP感染导致的疾病发生过程，而且也适用于研究HP感染后上皮-免疫细胞互作的相关机制。(https://www.daowen.com)
人类的腹泻症状主要是由人类诺如病毒（human norovirus，Hu No V）和轮状病毒感染胃肠引起的，但由于缺乏支持其复制的体外培养方法，因此尚未开发出合适的疫苗。作为单程培养的肠道类器官，其允许多种Hu No V毒株的广泛复制。Ettayebi等在类器官病毒共培养系统中模拟了Hu No V的感染［97］，发现只有特定的GII.3 Hu No V毒株需要胆汁。此外，肠类器官中组织血型抗原表达的缺乏限制了Hu No V的复制，表明该培养系统可以评估潜在的治疗和预防措施。同样地，来自临床样本的轮状病毒株也可以在PSCs衍生的肠道类器官中增殖［98，99］。除上述病毒外，伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）和艰难梭菌（Clostridium difficile）是导致人类腹泻的主要致病菌。Jessica L.Forbester等通过显微注射将伤寒沙门氏菌注射到iPSCs来源的肠道类器官中，发现了NF-κB信号通路的激活和炎症因子的分泌［63］。同样地，Jhansi L.Leslie等将艰难梭菌毒素注射到类器官的腔体内，观察到类器官上皮结构和屏障功能被破坏［100］。此外，与正常类器官相比，艰难梭菌感染的类器官表现出NHE3和MUC2的表达降低［101］。
2020年，由严重急性呼吸综合征病毒冠状病毒2型（SARS-Co V-2）引起的新型冠状病毒感染暴发，感染后表现出从轻度流感到严重肺损伤和多器官衰竭等症状。研究人员利用SARS-Co V和SARS-Co V-2感染了人小肠类器官，发现肠上皮支持SARSCo V-2复制，表明类器官可作为冠状病毒感染的实验模型［102］。同时，研究发现SARSCo V-2在人类肠道类器官中进行活跃复制，表明人类肠道可能是SARS-Co V-2的传播途径之一［103］。同时，单细胞测序数据表明人消化道包括食管、小肠和大肠中均表达新冠病毒ACE2受体，证实这些器官具有高度易感性。
4.肿瘤发生发展模型
胃肠道肿瘤患者数约占所有肿瘤患者的1/3，并且胃肠道肿瘤患者死亡率也处于较高水平［104］。对于胃肠道肿瘤发生发展机制、诊断和治疗方法的开发一直都是研究的热点。肿瘤发生发展机制的研究对肿瘤诊断和治疗技术的发展具有重要的推动作用。虽然目前对于胃肠道肿瘤研究取得了不少的成绩，但胃肠道肿瘤发生发展的相关机制仍有待进一步深入研究。
如今，我们已知经典的肿瘤发生发展机制大多来源于肿瘤细胞模型和小鼠肿瘤模型。肿瘤细胞系是体外研究肿瘤的重要模型，其建立和培养比较容易。正因为细胞系模型的这些优势使得很多生物学技术的开发都是基于细胞系模型开展的，这也进一步促进了科研工作者们利用肿瘤细胞系研究肿瘤发生发展机制的探索。虽然肿瘤细胞系模型为我们了解肿瘤发生发展机制提供了一个不错的研究工具，但是一个不争的事实是：基于肿瘤细胞系所获得的研究成果在临床应用中的转化失败率较高［105］。例如在针对靶向肿瘤治疗药物开发研究过程中，基于肿瘤细胞系筛选的结果在临床应用中往往效果并不理想［106，107］。肿瘤组织本身是一个由多细胞构成的动态混合体，同时，不同个体的肿瘤也存在不小的异质性。因此，同一种肿瘤的不同来源也会存在有明显的异质性。之前有研究团队搜集了来自两个不同实验室，共计106个不同的肿瘤细胞系进行全外显子测序分析。结果表明，来自两个实验室的同一种肿瘤细胞系存在明显的基因异质性［108］。不同环境培养的肿瘤细胞系也会存在差异，这也为肿瘤研究后续转化造成了阻碍。虽然相较于肿瘤细胞系模型而言，小鼠肿瘤模型可以更好地模拟体内状态下肿瘤发生发展环境，但值得注意的是，小鼠体内环境与人体内环境还是存在较大差异［109］。而肿瘤类器官模型不仅保留了肿瘤组织的结构，还保留了肿瘤组织内的微环境和多种细胞类群［110，111］。综上所述，为了克服传统肿瘤研究模型的局限性，肿瘤类器官成了一个非常不错的研究模型。本节将主要描述消化道类器官在食管癌、胃癌及结直肠癌发生发展机制探究中的应用。
（1）食管类器官模拟食管癌发生发展
食管类器官已被用于研究食管复层鳞状上皮的稳态增殖分化梯度，以及利用表达食管癌相关癌基因或肿瘤抑制基因缺失的食管细胞系，以研究正常和癌前病变的进展。食管类器官共培养癌细胞系和癌相关成纤维细胞可作为一种强大的工具，模拟侵袭性肿瘤前沿，以研究食管癌细胞的侵袭。癌基因和肿瘤抑制基因（如CCND1、EGFR、TP53和p120-catenin）以及炎性细胞因子（如IL-1β）已靶向小鼠食管上皮，以建立食管癌前病变、浸润性癌和肿瘤微环境模型［112］。基于食管鳞状细胞癌（ESCC）中TP53和KRAS基因频繁突变和早期癌前病变中TP53失活的研究［113］，对TP53和KRAS的遗传操作可能促进肿瘤类器官的发展。Biyun Zheng等［114］利用小鼠通过Cre-Lox P重组进行致癌KRAS（G12D）的条件性表达和TP53等位基因的敲除，验证了用KRAS（G12D）和TP53敲除可对食管类器官进行遗传操作，在体外（三维和二维培养物）和体内（小鼠移植）中再现了早期ESCC的发生过程。
（2）胃类器官模拟胃癌发生发展
人PSCs能够定向分化生成胃窦类器官，发育中的胃窦类器官经历了与小鼠胃窦发育几乎相同的分子和形态发生阶段。器官形成原始胃腺和凹陷样结构域、含有LGR5表达细胞的增殖区、表面和胃窦黏液细胞以及多种胃内分泌细胞。前文已经提及，利用胃窦类器官模拟人类疾病的发病机制时，Kyle W.McCracken等发现HP感染导致毒力因子Cag A与c-Met受体的快速关联，激活信号和诱导上皮细胞增殖。这与体外模型及动物模型中得出的结论相符，证明了胃癌类器官的可靠性［24］。
胃类器官的使用使得更多模式的研究得以进行，例如在个体化研究中，只有一小部分感染幽门螺杆菌的感染者发展为胃癌［115］，这可能是由于宿主遗传特征、微生物和环境决定因素之间的特异性相互作用所致。树突状细胞在人胃黏膜中被认为是重要的抵抗幽门螺杆菌感染的细胞。Thomas A.Sebrell等通过将从外周血单核细胞分离的人树突状细胞加入器官样培养物中，开发了一种体外共培养模型，可以探索免疫细胞在胃癌发病机制中的保护作用［116］。胃癌的异质性使其不太适合当前的“一刀切”标准诊断和研究模型，而胃类器官的发明和使用为胃癌的发病机制研究提供了更有利、更全面的模型。
（3）肠类器官模拟结直肠癌发生发展
随着肠道类器官技术的发展，科研工作者们逐渐开始利用肠道类器官模型研究肿瘤发生发展的机制。遗传突变在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色，经典的结直肠癌致病基因突变在类器官模型上可以得到很好的验证。在正常人肠道类器官中，利用CRISPR-Cas9过表达突变原癌基因KRAS和PIK3CA，以及敲除抑癌基因TP53和SMAD4后，将肠道类器官移植到小鼠体内可以模拟结直肠腺癌发生发展过程［117，118］。最近也有研究通过在他人肠道类器官中过表达R-spondin1来模拟锯齿状腺瘤的发生过程［119］。炎症性肠炎能够提高结直肠癌的患病风险，因此对于炎症性肠炎的研究是非常有意义的。最近一项关于炎症性肠炎研究中，患者来源的肠道类器官具有完整的上皮屏障功能，用EGTA处理肠道类器官可以破坏上皮屏障［120］。该模型有望成为肠道类器官炎症损伤模型。虽然目前利用肠道类器官研究肠道细菌与结直肠癌发生发展的研究较少，但肠道类器官的确是一个用于研究肠道细菌与结直肠癌发生发展的良好模型。最近有研究工作用肠道类器官来研究聚酮合成酶-致病大肠杆菌在结直肠癌发生过程中的作用。当研究人员将聚酮合成酶＋致病大肠杆菌注射至正常的人肠道类器官内，并连续培养5个月后，通过全基因组测序惊奇地发现，被感染的肠道类器官出现了一些与结直肠癌相似的基因突变［121］。这一结果为肠道菌群异常诱导肿瘤发生发展提供了一定的科学依据。
结直肠癌的发生发展机制目前仍然存在一些问题有待进一步研究，相信利用肠道类器官模型我们可以更加深入地了解肿瘤的发生发展机制，从而为结直肠癌的诊断和治疗提供科学理论基础。正常肠道类器官和结直肠癌的肿瘤类器官的建立方法已经成熟，但肠道其他肿瘤和肠道肿瘤相关的综合征在类器官水平上的模型还需要去建立和研究，同时，肠道类器官层面上的技术方法还需要广大科研工作者们的努力开发和普及。