4.3.2 肝脏类器官的功能鉴定
肝脏类器官所具有的功能是决定其应用的先决条件。肝脏类器官的功能鉴定主要包括肝细胞功能、胆管细胞功能，以及肝细胞与非实质细胞互作形成的功能的鉴定。
1.肝细胞类器官
肝细胞是肝脏中主要的功能细胞，具有ALB分泌、药物代谢和脂质储存等重要功能。肝细胞类器官要用作肝脏疾病模拟、药物代谢和毒性检测以及再生医学应用，必须维持肝细胞特异的功能。
Shinichiro Ogawa等结合三维培养和c AMP信号诱导，建立了从h PSCs来源的肝母细胞分化生成具有成熟代谢功能的类肝细胞的方法。hPSCs分化的类肝细胞自组装成三维类器官后，其功能进一步成熟。肝向功能基因如ALB、TAT和CYP450基因的表达，以及表达成熟肝细胞表面标记物ASGR1的肝细胞比例在肝细胞类器官中显著提高［17］。惠利健团队发现hiHep细胞形成的类器官中，肝细胞高表达成熟肝细胞特异基因，如HNF4A、E-cadherin、ALB和α1-抗胰蛋白酶等，表达谱分析进一步表明，hiHep类器官与人原代肝细胞的基因表达特征非常相似。此外，肝细胞类器官的ALB分泌、糖原储存、药物代谢和脂质运输等功能都表现出明显的改善，表明类器官中的肝细胞具有成熟肝细胞的功能和基因表达特征［23］。此外，也发现体外扩增后的人原代肝细胞重新自组装形成三维类器官可以促进其功能成熟［35］。
2.胆管类器官
胆管细胞在肝脏中主要发挥胆汁吸收和排泄的功能。PSCs来源的胆管细胞在基质胶中进行三维培养后会形成胆管类器官，并进一步成熟，表达多种成熟胆管细胞的标记物，如CFTR等，其中CFTR介导了胆管类器官的液体分泌功能。胆管类器官表现出成熟胆管的功能，包括胆汁酸转移、碱性磷酸酶活性、γ-谷氨酰转肽酶活性以及对分泌素、生长抑素和血管内皮生长因子的生理反应等功能［37，38］。原代胆管细胞自组装形成的多分枝胆管类器官——BRCOs中的胆管细胞表达CK19和CK7等成熟胆管细胞标记物。BRCOs在单细胞转录组水平上与原代胆管细胞高度相似，并再现了体内胆管细胞的异质性［63-66］。BRCOs也具有成熟胆管细胞的功能，如CFTR和水通道蛋白介导的离子和水的运输，以及碱性磷酸酶的活性［44］。(https://www.daowen.com)
3.复杂肝脏类器官
复杂肝脏类器官由于其具有复杂细胞组成和组织结构，所以能形成更为复杂的功能。肝胆类器官可以形成功能性胆管系统，能发挥肝脏胆汁排泄的功能。Yun-Shen Chan团队发现hiPSCs来源的肝胆类器官能分泌ALB和载脂蛋白B（apolipoprotein B），并且这些类器官具有CYP450酶活性，如CYP3A4酶活性，说明形成的类器官具备肝脏代谢功能。他们进一步分析了胆管细胞的功能，发现类器官可以分泌碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶，并且可以响应分泌素刺激，表明肝胆类器官同时具有肝细胞和胆管细胞的功能。他们利用荧光化合物5（6）-羧基-2，7-二氯荧光［5（and 6）-carboxy-2，7-dichlorofluorescein，CDF］或者6-羧基荧光素二乙酸酯（6-carboxyfluorescein diacetate，6-CFDA）模拟胆汁的分泌，通过活细胞成像可以观察到荧光化合物经由肝细胞代谢然后分泌进入胆小管，并最后汇聚到胆管类器官中，由此可见，构建的肝胆类器官能再现体内肝组织胆汁分泌的功能［49］。
Naoki Tanimizu等发现三明治培养体系中SH可以形成胆小管网络，而胆管细胞则可以形成管状结构，胆小管网络可与管状结构建立连接，他们将该形成的肝胆组织称为肝胆管状类器官（hepatobiliary tubular organoid，HBTO）［50］。为了进一步验证形成的胆管系统的功能，利用二乙酸氯甲基荧光素（CMFDA）处理HBTO，并检查该化合物是否在胆管组织中积累。在含有CMFDA的培养基中孵育HBTO 10分钟后，可在胆小管网络中检测到高浓度的荧光素。继续孵育120分钟后，发现荧光素被运输到胆管组织中。他们进一步将荧光标记的胆汁酸-胆酰赖氨酸荧光素（CLF）添加到培养基中，发现CLF被肝细胞吸收，但没有进入胆管细胞。处理30分钟后，CLF已分泌至胆小管中，6小时后在胆管组织中积累，说明分泌至胆小管中的CLF被转运至胆管组织中。这些结果表明，HBTO重现了体内肝胆组织运输肝细胞代谢产物的功能。
含有肝细胞和其他非实质细胞的类器官可以模拟肝细胞与非实质细胞间复杂的互作与功能。目前，已有研究可以通过诱导hiPSCs同时分化获得含类肝细胞和非实质细胞的类器官。利用该类器官可以模拟MAFLD表型，除了可以观察到肝细胞脂质积累的表型，还可以检测到纤维化和炎症因子分泌增加等表型［58］，表明复杂的肝脏类器官可以模拟在病理条件下多种细胞功能的异常以及细胞-细胞间复杂的互作。
利用器官芯片技术可以实现肝脏类器官与其他类器官的互作，构建复杂的人体生理系统，实现多器官功能的耦合［62］。利用该多器官系统可以进一步研究不同组织类器官对药物毒性或其他病理条件的响应，助力药物的研发。