4.4 肝脏类器官的应用与展望
在前面的内容里，我们介绍了构建肝脏类器官的培养方法。肝脏类器官技术的快速发展，极大拓宽了我们对于肝脏生理学和病理学的认知，并在建立新药的筛选方案和治疗策略等方面发挥了重要作用。以下，我们将从肝脏发育、再生、肝脏疾病以及药物筛选和再生医学等几个方面，介绍肝脏类器官的应用（图4-4）。
1.肝脏的发育
目前，我们所获得的肝脏发育的知识主要来源于动物模型。但是由于种属之间的差异，动物肝脏发育时间和涉及的信号通路与人肝脏发育存在较大差异。受限于伦理问题，我们很难利用人体组织研究肝脏的发育，因此人肝脏类器官为研究人类肝脏发育提供了强有力的模型。
通过模拟体内肝脏发育原理，研究人员已经证明可以通过逐步添加生长因子和化学小分子来诱导hESCs或hiPSCs分化形成类肝细胞［3］，但是这些研究主要获得的是二维的类肝细胞，缺乏肝脏发育的三维结构信息。
目前，利用肝脏类器官可以模拟人类肝脏发育的三维结构信息以及空间多细胞互作信号调控。Takanori Takebe研究团队通过模拟早期肝芽发育中多细胞互作过程，首次实现了体外肝芽的构建。他们将hiPSCs分化的肝内胚层细胞、人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞共培养，发现这些细胞可以自组装形成三维结构，并促进肝内层细胞的分化成熟［51］。通过单细胞测序进一步分析发现，“肝芽”类器官中肝母细胞与二维培养的肝母细胞表达谱特征不同，这些细胞表达上皮细胞迁移的标志基因，反映了器官出芽的特征。进一步建立“肝芽”类器官中不同谱系细胞间复杂的互作网络后发现，VEGF信号介导的互作参与了血管网络的形成以及肝母细胞的分化［67］。这些数据表明类器官中不同谱系细胞间的互作可调节类器官的发育。目前，关于肝脏发育的调控机制还存在众多未知问题，肝脏类器官为我们探究这些问题提供了新的研究工具。
图4-4 肝脏类器官的应用
2.肝脏的再生
肝脏作为机体新陈代谢和解毒中心，不可避免地会接触外界有毒物质和机体产生的代谢废物，因而受到损伤，肝脏强大的再生能力是维持肝脏稳态和正常功能的重要保障。肝脏的再生涉及细胞的再生和肝脏结构的重建，理解肝脏再生的分子与细胞机制对于促进肝脏损伤后再生具有重要意义。肝脏类器官为解析肝脏再生机制提供了良好的体外模型。目前，肝脏类器官用于肝脏再生的研究主要集中在理解肝脏损伤再生信号与细胞互作方面。
肝脏组织分离获得的肝细胞和胆管细胞都可以在体外自发形成类器官结构，研究者们想探究这些类器官形成过程是否反映了肝脏再生的分子特征。胡慧丽团队利用小鼠肝组织以及人胎肝组织分离获得的肝细胞在体外形成了肝细胞类器官，他们将获得的肝细胞类器官进行了单细胞测序并与原代肝细胞聚类分析，发现这些类器官相较于正常肝细胞更接近于肝切再生的肝细胞状态。进一步将正常肝细胞和肝切再生肝细胞的差异基因挑选出来进行分析，发现类器官富集了肝切再生过程中上调和下调的基因［31］，表明肝细胞类器官在形成过程中体现了肝细胞再生的表达谱特征。
除了肝细胞类器官外，Meritxell Huch团队利用获得的胆管类器官进行了胆管再生过程的探究。他们从小鼠肝组织中分离原代胆管细胞并构建胆管类器官，发现肝脏损伤过程中胆管细胞出现的差异基因有71%与胆管类器官形成过程中差异基因的表达模式一致［68］，表明胆管类器官能反映肝脏损伤过程中胆管细胞的表达谱特征。他们还发现新分离的胆管细胞大部分处于有丝分裂间期的G0/G1期，暗示胆管细胞在形成类器官之前都处于非增殖的状态。为了进一步探究胆管类器官起始过程的分子特征，他们对胆管类器官起始以及形成类器官之后的细胞进行了表达谱分析，发现胆管细胞进入细胞周期之前上调了与染色质调控相关的基因表达，包括Hdac2、Baf155、Tet1等，而这些基因同样也在肝脏损伤诱导的胆管细胞中上调。他们进一步证明了Tet1介导的羟甲基化及其调控的ErbB-MAPK和YAP-Hippo信号通路调控了胆管类器官的起始，以及体内胆管细胞的再生［68］。这些结果表明了类器官作为体外模型研究体内再生机制的潜力。
值得注意的是，在肝脏受到损伤后，肝脏中多种细胞会参与肝组织的修复过程，实现肝脏的快速增殖修复。为了探究其他细胞在再生过程中的作用，Meritxell Huch团队利用类器官共培养系统首次揭示了基质细胞对于胆管细胞增殖的双向调控作用。具体来说，他们发现在小鼠肝脏中有一群SCA1＋PDGFRa＋间充质干细胞与胆管距离很近，并分泌促肝脏再生的生长因子，在肝脏损伤再生过程中这群间充质干细胞与胆管细胞的比例以及相互接触会发生动态变化，暗示其可能在胆管细胞再生过程中具有重要作用。为了进一步探究SCA1＋PDGFRa＋间充质干细胞对胆管细胞再生的作用，他们将SCA1＋PDGFRa＋间充质干细胞与胆管类器官共培养，发现这群间充质干细胞可以通过旁分泌方式维持胆管类器官的生长。他们还发现这群间充质干细胞与胆管细胞的比例对胆管类器官的增殖有截然相反的作用，当间充质干细胞与胆管细胞比例接近1∶10时，会提高胆管细胞的增殖速率，但是当充质干细胞与胆管细胞的比例超过1∶10时，则会显著抑制胆管细胞的增殖［69］，表明这群间充质干细胞还可以通过与胆管类器官的互作接触双向调控胆管细胞的增殖。这些研究工作为我们理解肝脏再生提供了新的见解。
3.肝脏肿瘤
原发性肝癌，主要包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC），大多数肝癌在发现时已处于晚期且预后差［70］。理解肝癌发生发展的机制，发现新的治疗靶点和有效的治疗药物，对于提高肝癌患者的生存率具有重要意义。利用类器官技术构建的肝癌类器官能反映来源肿瘤的遗传异质性和组织结构特征，是良好的肝癌发病机制研究和药物筛选的模型；此外，结合基因编辑技术还可以在正常肝脏类器官中引入致癌基因研究其在肝癌发生发展中作用，进一步揭示肝癌早期发生的机制，助力肝癌早期诊断和预防。
目前针对肝癌类器官的构建主要分为两种方式，第一种是利用肝癌患者来源的癌组织直接构建肝癌类器官。2017年，Meritxell Huch团队从手术切除的肝癌组织中获得癌细胞，并建立了体外长期培养肝癌类器官的培养系统［71］。Markus H.Heim团队则建立了从穿刺活检样本中构建肝癌类器官的方法［72］。通过与癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中肝癌组织的表达谱进行对比分析，发现肝癌类器官能较好地维持肝癌标志物的表达。同时，肝癌类器官在组织形态以及突变基因上均能保持其原始肿瘤组织的特征。通过将肝癌类器官移植至免疫缺陷的小鼠体内，能够形成肿瘤并维持其来源肿瘤组织的结构特征。以上数据表明肝癌类器官可以很好地模拟体内原始肿瘤组织的分子与结构特征。(https://www.daowen.com)
第二种方法则是利用基因编辑技术对正常肝脏类器官进行修饰和改造，获得遗传改造的类器官。2019年，惠利健团队利用hi Hep构建了肝细胞类器官，他们在类器官中过表达了c-MYC基因来探究其在HCC起始中的作用。他们发现过表达c-MYC基因后，肝细胞类器官中线粒体相关的内质网膜系统呈现异常的结构特征，内质网与线粒体距离很近，内质网紧贴在线粒体膜上，改变了原有的线粒体的裂变和有氧呼吸，原位移植到小鼠体内可以形成HCC。他们也在该类器官中引入了胆管癌相关的致癌因子，并发现RAS等基因可以使重编程的肝细胞不经过前体的阶段直接转变为胆管癌，首次证实了胆管癌可以由肝细胞直接转变形成［23］。Benedetta Artegiani等在正常胆管类器官体中研究了BAP1的功能，他们发现BAP1的功能缺失破坏了胆管类器官体的上皮组织结构和细胞极性，进一步基因组学分析发现BAP1的缺失会影响细胞相互作用和细胞骨架相关基因的可及性［73］。这些研究表明结合基因编辑技术和类器官体培养技术可以模拟癌症的发生发展和研究特定基因的功能。在肝癌中，很多癌症相关的基因频率只有5%左右，往往缺少对应的患者来源的细胞模型，而想要研究这些基因在癌症中的作用以及对药物的响应，可以通过基因编辑技术在正常类器官体中引入这些基因进行相关的研究。
4.感染性肝病
肝脏是许多病毒以及疟原虫的靶向器官。2015年，全球病毒性肝炎造成134万人死亡，其中，66%是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的慢性肝炎并发症造成的［74］。虽然已经有研究利用人肿瘤细胞系或者人源化的小鼠模型来研究HBV的感染，但是人肿瘤细胞系难以反映肝脏的正常生理功能，而动物模型耗费巨大，并且难以实现高通量药物筛选，这些局限性限制了这些模型在HBV感染机制研究中的应用［75］。肝脏类器官由于维持了肝细胞主要功能以及部分结构，因此适用于宿主肝细胞与外源病毒感染的相关研究。2019年，鄢和新团队建立了原代肝细胞类器官，并发现培养的原代肝细胞在形成类器官后，其肝向功能提升［36］。他们将培养的肝细胞类器官暴露在HBV环境中，发现肝细胞类器官能感染HBV，表达乙肝表面抗原、e抗原以及合成乙肝病毒的cccDNA。Hideki Taniguchi团队利用hiPSCs分化获得的类肝细胞与脐静脉内皮细胞和间充质干细胞共培养形成复杂肝脏类器官，相较于hiPSCs分化获得的二维培养的类肝细胞具有更高水平的NTCP的表达，可以长时间维持HBV感染［76］。目前，肝脏类器官在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染机制研究中也有一些研究进展［77］。这些肝脏类器官模型的构建对于病毒性肝炎的发病机制研究以及药物研发具有重要意义。
5.其他肝脏疾病
在过去20年里，由于肥胖、2型糖尿病以及代谢综合征患病率的快速上升，MAFLD逐渐成为世界慢性肝脏疾病的主要发病原因。据2018年统计，大约25%的世界人口患有MAFLD［78］。MAFLD的发展从单纯的肝细胞脂肪变性开始，如果不加以诊断以及后续治疗，则会出现炎症浸润和肝细胞空泡化，从而演变为非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），在没有过量饮酒的条件下发展为肝纤维化，并最终导致终末期肝病甚至肝癌［79］。然而目前并没有针对MAFLD的药物，由于缺乏相应治疗手段以及全球肥胖流行率的快速升高，未来几十年MAFLD患病率可能会进一步提高，给全球带来严重的医疗负担［78］。
相较于细胞系和动物模型，肝脏类器官具有维持肝细胞代谢功能，同时造模时间相对较短的优势，因此利用肝脏类器官来模拟NASH成为研究的热点。2019年，Takanori Takebe团队利用hiPSCs在体外诱导分化形成包含类肝细胞、HSC、胆管细胞和Kupffer细胞的复杂类器官［58］。通过在培养基中添加游离脂肪酸，他们发现复杂类器官中出现了脂肪变性、纤维化程度增加以及免疫细胞浸润增多等表型，模拟了体内脂肪肝炎的主要病理特征。此外，通过添加FGF19蛋白可以减缓肝脏类器官的脂肪肝炎症状，初步显示了复杂类器官在药物筛选的潜力。为了进一步探究人群中易感基因对于MAFLD的影响，他们从24名供体中提取细胞并进一步诱导分化为肝脏类器官，并在游离脂肪酸的处理下诱导NASH的病理表型。通过将类器官的NASH病理表型与遗传变异进行关联分析发现，葡萄糖激酶调节蛋白（glucokinase regulator，GCKR）与肝脏类器官的脂质积累具有明显的相关性［80］。他们进一步将不同基因型的GCKR肝脏类器官分别使用游离脂肪酸处理来模拟NASH，其中，GCKR-rs1260326 TT基因型的肝脏类器官积累了更多的脂质，说明该基因型的类器官对于脂肪酸处理更加敏感。同时，还发现没有2型糖尿病的GCKR-rs1260326 TT基因型的NASH患者表现出了更少的肝脏损伤的表型，但是患有2型糖尿病的GCKR-rs1260326 TT基因型的NASH患者则表现出了更严重的炎症反应，表明不同疾病的代谢状态会协同GCKR影响MAFLD的病程。
MAFLD除了诱导细胞层面的变化外，还会引起肝脏三维结构的变化。为了探究MAFLD相关的组织结构变化，Yun-Shen Chan团队利用hiPSCs分化获得的肝胆类器官模拟了脂肪酸诱导的胆小管结构变化［49］。他们发现在培养的类器官中添加游离脂肪酸，破坏了肝胆类器官中胆小管网络的形成，模拟了NASH患者中肝组织胆小管三维结构变化的病理表型。但是，肝脏类器官是否可以完全模拟MAFLD由单纯脂肪变性逐步发展为终末期肝病的整个发展过程，仍有待于进一步探究。
除了代谢性脂肪肝病，肝脏类器官还可以模拟酒精性脂肪肝病的病理特征。王韫芳团队将胚胎来源的间质细胞与hESCs来源的肝脏类器官共培养，构建了一个人源化多细胞肝脏类器官模型［81］。他们发现用乙醇连续处理肝脏类器官7天后，肝脏类器官出现了纤维化、炎症因子上调、氧化应激和线粒体功能失调等病理表型［81］，表明肝脏类器官能在体外模拟酒精性脂肪肝病的众多病理特征。除上述提到的继发性肝脏疾病，也有部分研究利用患者来源的肝细胞或者胆管细胞在体外直接培养形成类器官，用于模拟遗传性肝脏疾病。其中包括从囊性纤维病［37］、α1-抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin，A1AT）缺乏症［39］、威尔逊氏症［82］和Alagille综合征［47］中获得患者组织用于构建类器官模型，这些类器官能反映相应疾病的主要病理特点，加深了我们对于遗传性肝病的进一步理解。
6.药物筛选
肝脏类器官为药物筛选和药物毒性测试提供了新平台。患者来源的类器官体模型（patient derived organoid，PDO）能反映来源癌症组织的基因组变异特征，可以作为临床前体外模型检测患者对不同药物的响应，筛选有效的治疗药物［71，72］。Meritxell Huch团队在体外测试了不同PDO对药物的敏感性，发现PDO对ERK抑制剂SCH772984非常敏感，暗示ERK是肝癌治疗的潜在靶标［71］。此外，通过构建肝癌类器官模型平台来反映肝癌患者的遗传异质性，并整合高通量药物筛选和基因组测序数据，可以系统性研究肝癌基因与药物的关联性，发现潜在的分子标志物和药物作用靶点。但是目前肝癌类器官模型数量较少，不足以反映肝癌患者的遗传异质性，未来可以进一步构建更多的肝癌类器官模型，从而建立肝癌类器官模型平台。
药物诱导的肝脏损伤（drug induced liver injury，DILI）是导致急性肝脏衰竭以及药物研发失败的主要原因。一直以来，DILI缺乏良好的研究模型。利用正常肝细胞形成肝细胞类器官，可用于预测DILI，指导后续药物的开发［83-85］。2021年，Takanori Takebe团队通过hiPSCs细胞分化形成的前肠细胞，在生长因子的诱导下形成肝细胞类器官。该肝细胞类器官表达胆小管的标志物，例如BSEP、MRP2、ZO-1等，并且具有胆汁合成以及分泌的功能。进一步利用该肝细胞类器官构建了高通量药物筛选系统，并且测试了市售的238种药物对这些类器官的细胞存活率以及胆汁贮存能力的影响，他们发现那些会造成胆汁淤积的药物同样会造成类器官胆汁排泄的异常。他们还通过分析不同药物的临床最大药物浓度（Cmax），证明该类器官筛选系统对于预测药物诱导的肝脏损伤的灵敏性和特异性分别达到88.7%和88.9%［85］。这些结果体现了类器官系统应用于预测DILI的潜力。
7.再生医学应用
肝脏原位移植目前仍旧是治疗终末期肝脏疾病的唯一有效手段。然而肝源短缺极大限制了肝脏原位移植的应用。发展其他可行的替代疗法，对于治疗终末期肝脏疾病具有重要意义。肝脏类器官具有可扩增以及功能成熟的特点，可以克服目前肝源短缺的难题，成为治疗肝脏疾病的一种新的替代方案［86］。
胡慧丽等将胚胎肝细胞类器官消化成单细胞后，移植到Fah基因缺失小鼠中，他们发现胎肝细胞在小鼠体内定植生长，并持续表达肝细胞特异性标志物，同时下调胎肝细胞的标志物，提示其在小鼠体内进一步成熟［31］。Takanori Takebe等利用h PSCs体外诱导分化为肝脏内胚层细胞，并与内皮细胞和间充质干细胞混合培养，形成肝芽结构，将其移植到免疫缺陷小鼠体内，可以挽救药物诱导的致命性肝衰竭［51］。他们进一步建立了大规模生产肝芽类器官的方法，可以获得超过108个类器官并稳定维持肝细胞功能，推动了类器官的临床转化研究［87］。Ludovic Vallier团队从肝组织中不同胆管位置分离出胆管细胞并分别构建胆管类器官，进一步将其消化成单细胞后移植到亚甲基二苯胺（4，4′-Methylenedianiline，MDA）诱导的胆管损伤的小鼠体内，发现胆管类器官显示出了一定的治疗效果［88］。他们还将胆管类器官直接移植到体外常温灌注保存的人类肝脏中，培养100小时后，发现胆管细胞在肝脏组织中整合，同时部分修复了肝组织的胆汁分泌功能［88］。这些基于类器官的移植治疗工作，给相关的肝脏疾病治疗提供了全新的策略和思路。
（惠利健，章正涛，李春，金悦）