6.3.3　前列腺类器官的鉴定

前列腺类器官已经成为研究前列腺细胞谱系、生理功能和病理状态的重要工具。对于前列腺类器官的鉴定，主要围绕前列腺类器官形成的不同条件和不同细胞起始的前列腺类器官最终的状态展开。

1.前列腺类器官与细胞因子

目前，从消化前列腺到构建出相应的类器官，通常仅需要两周的时间。而构建出的类器官可以用于研究前列腺生物学的许多不同方面，包括前列腺稳态、前列腺癌发生和前列腺疾病相关治疗药物的发现。当然，前列腺类器官的培养方式也并非一成不变的，可以按照不同的需求加入不同的成分，因为前列腺类器官对于每种成分的相对需求有所区别，对各种成分所产生的相对效应也不一致，当然，这也反映了前列腺对于不同因子的响应并不相同。在前列腺培养基中添加Noggin可以增加类器官在初始定植过程中形成的数量，并产生了更高的生长率。但Noggin并不是连续传代中所必需的，这与Noggin敲除小鼠前列腺发育的观察结果一致，其中Noggin的敲除导致骨形态发生蛋白（BMP）信号传导过于活跃，导致增殖的前列腺上皮细胞比例降低和前列腺出芽减少。类似地，Wnt激动剂R-spondin增强了类器官的形成能力，提高了类器官的生长速率，但Rspondin不是类器官生长所必需的。与此相对应的是，在前列腺发育过程中，R-spondin和Wnt在泌尿生殖窦中广泛表达，Wnt信号对前列腺发育至关重要。此外，R-spondin受体Lgr4对前列腺发育和分化是必不可少的，与此对应的是前列腺类器官会表达Lgr4和Lgr5。二氢睾酮不是必需的，但二氢睾酮的加入能够显著提高类器官形成的效率。

2.细胞群进行鉴定(https://www.daowen.com)

多年来，组织重组实验（Tissue recombination assay）一直被认为是验证前列腺上皮细胞群干细胞或祖细胞潜力的金标准，通过该方法，CD117（即c-kit，一种干细胞因子受体）等分子被鉴定为前列腺干细胞群的标志物，也利用该方法验证了前列腺研究的热点分子——Nkx3.1维持前列腺细胞干性的功能。然而，随着类器官技术的发展，近年来，前列腺类器官技术逐渐成为干细胞或祖细胞特性测定的另一种主要方法。

有研究表明，基底细胞和管腔细胞都能够形成前列腺类器官。基底细胞和管腔细胞形成类器官的能力有差异，种植同样数目细胞的情况下，基底细胞形成类器官的数目会远高于管腔细胞。利用免疫组织化学染色等方式可以看到，这两种细胞形成的类器官都会表达基底细胞的标志分子（p63，Ck5）和管腔细胞的标志分子（Ck8）［85］。这与在前列腺最初阶段的发育过程中基底干细胞和管腔干细胞都具有分化成基底细胞和管腔细胞能力的结果是相符的。这种表型与前列腺非常相似，表明前列腺中存在双能管腔祖细胞和双能基底祖细胞。基底细胞来源的类器官和管腔细胞来源的类器官都能维持至少4个月的传代，同时保持稳定的核型。当使用组织重组实验将前列腺类器官与泌尿生殖间充质细胞放置在肾包膜下时，会产生重组前列腺。重要的是，在用源自前列腺各个位置的类器官传代8次后，这种重建特性得以保留，表明前列腺祖细胞的干性能够以类器官的形式长期保留。

曾有研究者利用组织重组实验鉴定出的一类前列腺祖细胞——抗去势Nkx3.1表达细胞（castration-resistant Nkx3.1-expressing cells，CARNs，一种管腔祖细胞群），当将其作为类器官培养时，能够对外源的雄激素做出相应反应。此外，抗去势Nkx3.1表达细胞衍生的类器官可以在组织重组实验中形成前列腺导管，这表明由该类细胞产生的类器官中能够保留前列腺上皮祖细胞特性。位于尿道附近的Sca-1＋Nkx3.1-管腔细胞在雄激素剥夺的小鼠中比例升高，这些细胞表达雄激素受体，却不具有分泌功能。利用少数这类细胞构建的类器官能够产生形态上不同于其他细胞群形成的类器官，这也暗示了这类细胞可能在去势抗性前列腺癌中作为癌细胞的来源。同样，利用前列腺类器官技术，Ly6d＋管腔细胞和Zeb1＋基底细胞也被认为可能存在一定的干细胞或祖细胞特性。针对管腔细胞的分群进行研究，也充分利用了类器官这一有力的工具［84］。

上文中提到前列腺管腔细胞可以分为三群，即管腔A细胞、管腔B细胞和管腔C细胞。管腔C细胞具有相对于管腔A细胞和管腔B细胞更强的增殖能力，这一点可以利用类器官培养验证得到，前列腺近端和远端的管腔C细胞的类器官形成比例分别高于其他类型的管腔细胞三倍和六倍。前列腺类器官既会保留细胞的干性，又能够较好地保留细胞的表达谱。前列腺上皮来源的类器官会保留雄激素受体，加入二氢睾酮72小时后，CK8＋管腔细胞会强烈地极化，体积也会明显增加。雄激素受体的靶基因Kfbp5和Psca的表达也明显上调。有趣的是，来自不同前列腺上皮干细胞或祖细胞的类器官表现出不同的形态，例如圆形半透明、圆形致密、不规则致密或具有多细长结构的不规则，这表明由于基底细胞和管腔细胞的组成和排列不同，类器官内部的组织形态也不尽相同。总之，已有越来越多的研究表明前列腺类器官能够表征前列腺细胞的干细胞或祖细胞特性，而应用前列腺类器官技术，也能够为前列腺发育的研究提供重要线索和关键证据。