6.3.4 前列腺类器官的应用
前列腺类器官是研究前列腺生物学特征的重要模型之一。利用前列腺类器官，可以对前列腺的各种细胞群及细胞亚群进行鉴定，确定其各自的干细胞或祖细胞特性等；同时，利用前列腺癌类器官模型，既可以对各基因对于前列腺癌发生发展的作用进行探究，又能够研究不同来源的细胞对前列腺癌的贡献，同时还能够评估针对前列腺癌的抗癌药物的有效性。随着单细胞RNA测序等大量生物学新技术的兴起，前列腺类器官能够较好地保留原组织基因组和转录组的优点也使其在科研中越来越具有优势，也越来越成为研究前列腺生物学特点的重要手段。当然，同其他所有生物学技术一样，前列腺类器官技术同样存在一定的局限性，如何消除或规避这些局限性也是前列腺类器官研究领域绕不开的话题［92］。
1.前列腺癌研究
前列腺类器官能够保有前列腺细胞的特征，前列腺癌细胞来源的类器官也能够反映前列腺细胞癌变后的一些特征。前列腺类器官技术的出现，也让前列腺癌研究长期没有合适的体外模型的问题得到解决［93］。
2014年，陈俞等［94］报道了7种来源于不同疾病部位（包括循环肿瘤细胞）的人源性前列腺癌类器官系以及其详细的分子表征。这些类器官系具有原发性前列腺癌的基因组特征，包括TMPRSS2-ERG融合、SPOP突变和CHD1缺失，以及去势抗性前列腺癌中常见的改变，包括TP53、PIK3R1、FOXA1和几种DNA修复以及染色质修饰通路相关基因的突变。此外，类器官系展现了去势抗性前列腺癌的表型多样性，包括雄激素受体依赖性肿瘤、雄激素受体阴性肿瘤、神经内分泌肿瘤和鳞状分化。利用这些类器官系，还可以进行体外和体内抗肿瘤药物的测试，为寻找合适的抗肿瘤药物提供依据。后续也有许多科研团队建立起了前列腺癌的类器官模型，例如有研究者从神经内分泌前列腺癌的转移灶中用活检针取得了部分癌组织，并培养出类器官。利用这些类器官，研究人员初步揭示了参与组蛋白甲基转移的EZH2蛋白在驱动神经内分泌前列腺癌相关进程中的作用。LuCap PDX模型是一个大型的、具有良好特征和临床意义的晚期前列腺癌PDX模型（patient-derived xenograft models，一种将患者肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠，从而使肿瘤组织能够较为稳定的传代和保持自身基因组和转录组信息），有研究者尝试从LuCap PDX模型出发构建前列腺类器官，并发现产生的类器官能够较好地保留PDX模型的谱系标记和转录组。尽管并非所有测试的LuCap PDX模型都能产生可以连续繁殖的类器官，但这项研究依然提示我们利用前列腺类器官技术可以从现有且特征良好的PDX模型中建立代表性肿瘤模型［95］。
很早便有科研团队利用基因编辑小鼠对前列腺癌展开研究，常见的随着基因编辑方法产生前列腺癌手段有敲除Pten、敲除Rb、敲除P53、过表达ERG等几种方式的组合。随着基因编辑技术的进步，可以在源自野生型前列腺上皮或基因编辑前列腺癌小鼠模型的类器官中容易地进行基因操作，从而有助于在肿瘤起始和进展期间对前列腺不同上皮谱系或亚群中的基因或基因组合进行功能分析。例如，有的科研团队使用设计了基于CRISPR-Cas9的基因编辑策略进行TMPRSS2-ERG基因融合的试验方案，利用转基因技术对野生型小鼠上皮细胞产生的前列腺进行基因编辑，构建出TMPRSS2-ERG基因融合的类器官，并利用该类器官研究TMPRSS2-ERG基因融合在前列腺癌早期的作用。对于Tip5在前列腺癌发生和发展过程中的功能作用的评估，也是通过对前列腺类器官进行基因编辑实现的［96］。从野生型小鼠前列腺细胞培养的类器官，敲低Pten后，前列腺类器官变得更加坚实、紧凑，而倘若在Tip5敲除的前列腺类器官中敲低Pten，则会生成半透明的具有双层结构的类器官，这暗示了Tip5的缺失影响了Pten缺失的前列腺管腔细胞转变为癌细胞的能力。有趣的是，颠倒前列腺管腔细胞中Tip5和Pten缺失的顺序则不能抑制Pten缺失介导的癌变，这意味着癌变过程中基因突变的时间顺序的重要性。而类器官相对容易进行基因编辑的特点也有利于进行基因突变时序的探究。其他利用对前列腺类器官进行基因编辑的研究包括对SPOP、BAF、FOXA1和ERG等基因对前列腺癌发生发展的研究。值得注意的是，将SPOP的133位的苯丙氨酸突变为缬氨酸，结合Pten缺失可以导致PI3K/m TOR和雄激素受体依赖但ERG不依赖的侵袭性前列腺腺癌的形成；而BAF、FOXA1和ERG则被确定为是前列腺癌中维持管腔同一性的重要调节因子［97］。与其他前列腺癌模型相比，这些结果突出了前列腺类器官技术在基因功能分析中的优势，包括时间和成本效率以及易于按照不同时间顺序对不同的基因进行编辑。
2.前列腺癌药物评估
通过准确保存人类前列腺肿瘤的遗传和表型特征，前列腺类器官技术产生的肿瘤类器官系可用于抗肿瘤药物的敏感性和测试研究。良好的靶向药物对于癌症患者的精准治疗至关重要，不同癌症的不同突变类型会导致对于药物的敏感性产生巨大差异。在诊疗过程中，精准用药已越来越成为癌症治疗的基本要求。
然而，因为缺乏精准到个人的用药评估手段，精准治疗仍然面对着诸多挑战。利用从前列腺癌症患者体内的癌细胞培养的类器官可以发现，具有Pten缺失和PI3KR1突变的类器官，对于PI3激酶途径的抑制剂依维莫司（Everolimus）敏感；高表达雄激素受体的类器官则对雄激素受体的拮抗剂恩杂鲁胺（Enzalutamide）敏感，而低表达雄激素受体的类器官则对其具有耐药性［98］。对于高表达雄激素受体且Pten缺失和PI3KR1突变的类器官，同时使用PI3激酶途径的抑制剂和雄激素受体的拮抗剂可以显著提高类器官对于药物的反应。与使用基因编辑小鼠前列腺癌模型或PDX模型的常规临床前研究相比，前列腺类器官技术方法大大减少了药物疗效评估所需的时间和成本。与之相类似的研究还有，从具有BRCA2缺失突变的前列腺癌患者癌组织培养的类器官对于PARP抑制剂奥拉帕利（Olaparib）较为敏感，而当将该抑制剂用于患者治疗后确实产生了比较好的治疗效果，这也体现了使用前列腺类器官技术为患者提供及时治疗选择的优势。
此外，其他研究小组还利用前列腺类器官技术评估靶向治疗对去势抗性前列腺癌和神经内分泌前列腺癌中不同基因改变的细胞毒性效应，包括EZH2、雄激素受体突变和扩增，以及SPOP突变和Aurora A的表达。更重要的是，一些不同的研究小组的研究也证明了使用肿瘤类器官模型进行药物敏感性评估的可行性。例如，携带SPOP突变的前列腺肿瘤类器官对BET抑制剂更具抗药性；具有ALK蛋白114位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸的肿瘤类器官对各种ALK抑制剂表现出不同的反应；去势抗性前列腺癌衍生的前列腺肿瘤类器官SLFN11的表达状态可以预测前列腺癌患者对于铂类药物化疗的反应和预后［99］。(https://www.daowen.com)
值得注意的是，前列腺类器官技术也可以用于筛选单一治疗方式或组合治疗方案新的候选药物。例如，有研究者使用前列腺肿瘤类器官模型证明，靶向GPX4（前列腺癌神经内分泌分化的重要调节因子）导致了癌细胞的铁死亡；对于脂肪酸摄取和从头脂肪生成途径的双重靶向可以显著抑制源自PDX模型的前列腺肿瘤类器官的生长，TOP1抑制剂茚并异喹啉（Indenoisoquinoline）和PARP抑制剂奥拉帕利在同源重组缺陷和SLFN11阳性前列腺肿瘤类器官中发挥着协同作用［100］。目前，有一些团队正在致力于建立人前列腺癌的类器官库，他们通过收集大量患者的前列腺组织，并建立相应类器官，利用单细胞测序等组学手段对前列腺癌进行系统性研究。同时，可以利用前列腺癌的类器官库对药物进行筛选，从而大大提高了前列腺癌抗癌药物筛选的速度。总之，这些结果突出了前列腺类器官技术是一个有效的体外药物测试平台，可以用于发现和验证前列腺癌的潜在药理学模式［92］。
3.前列腺类器官技术挑战
理想情况下，前列腺类器官应该能够反映患者前列腺肿瘤的生物学特征。最终，利用患者肿瘤组织来源培养的类器官能够用于探索指导对患者的个性化治疗。为实现该目的，目前还需要解决前列腺类器官所面对的一些技术挑战和限制。
首先，并非所有前列腺癌患者的组织都能够用于制备类器官。造成类器官培养失败的原因有很多，包括培养基条件不适宜、细胞状态不好、细胞数目不够、被其他类型细胞挤占生存空间等。因为肿瘤细胞的异质性，即使相同类型的肿瘤，其培养条件也不尽相同，培养基中所需的细胞因子也有所差异，倘若没有选用合适的培养基，便会造成类器官难以生长的结果。患者的肿瘤组织在收集、运输等过程中，不可避免地造成细胞的损伤，加之从组织块消化成为单细胞的过程中，剪刀等造成的机械损伤和消化酶等造成的化学损伤也有可能会使细胞状态下降，最终导致类器官培养失败。因在从癌组织提取到类器官培养过程中，不可避免地造成细胞数目的损失，若初始的细胞量不够，最终也会导致观察不到类器官的形成。尽管癌细胞在体内有着较高的生长优势，但在体外状态下，可能会被其他更具有生长优势的细胞取代，直至消失。
另外，需要注意的是，即使养成了类器官，对于类器官传代次数也需要谨慎考量，过多的传代可能会使类器官偏离原有癌组织的生物信息，导致对癌组织信号通路改变的判断的偏差和抗癌药物的药敏实验结果的不准确。因此，我们既需要充分考虑肿瘤之间的异质性，注意总结规律、选取合适培养的培养基，又需要开发适用面更广泛的培养基；在类器官运输过程中，尽量采用低温运输的方式，在对肿瘤组织进行操作的过程中也要尽量减小对细胞的损伤；同时，进行前列腺类器官的传代时，可以主动去除基质细胞等其他类型的细胞形成的类器官，尽量保证癌细胞形成的类器官的生长优势。
大多数前列腺癌药物研究是使用可用的前列腺类器官模型进行的，前列腺类器官模型中主要是上皮细胞，没有基质成分，如免疫细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。大量证据已经表明，上皮-基质相互作用在前列腺发育和癌变过程中起着至关重要的作用，并可能参与调节药物对肿瘤细胞的作用。有研究发现，正常的乳腺组织的上皮细胞类器官和其对应的组织之间存在显著的表型差异，有的乳腺上皮类器官出现了CD10的丢失和CD44表达的增加。这很有可能是因为在建立类器官时基质相互作用细胞或固有组织结构的丢失，而且前列腺类器官很有可能也会有类似的问题［101］。所以，倘若想要类器官保持完整的组织结构和增殖能力，基质是重要的整合成分。对前列腺癌研究人员来说，将基质成分整合到前列腺类器官培养中仍然是一项具有挑战性的任务。在这一过程中，研究人员需要解决的问题包括：确定有利于基质细胞和上皮细胞生长的条件，确定不同基质群体与上皮细胞或癌细胞的比例，确定基质细胞和细胞外基质的类型和组成，确定合适的细胞外基质的硬度，以及合适的氧气和血清的供应。随着正常前列腺上皮和前列腺肿瘤的单细胞RNA测序分析的发展，我们可以更好地了解正常稳态和癌变过程中前列腺的细胞组成的变化。结合我们对前列腺癌基因组和代谢组学特征的理解，前列腺类器官技术的未来发展应考虑结合和保留肿瘤微环境以及间质细胞等与肿瘤相互作用的细胞。这种与体内环境更加类似的前列腺类器官也有利于促进对疾病进展的更好理解，并加速新型抗癌药物的开发。
无论如何，前列腺类器官仍然是一种体外培养系统，没有体内生理过程，因此，仍难以完全替代动物模型。例如，单纯使用前列腺类器官，很难指征血管生成、转移在肿瘤发生发展中的作用。此外，体内模型仍然是监测药物动力学和药效学、不良反应或受试药物毒性的金标准［102］。不论是基础研究还是临床研究，都要注意面对不同的条件和要求时选用不同的生物学模型，这样才能够取得准确严谨的科学结果。
（高栋，彭韵怡，邵先龙，王烁铭）