8.1.2 心脏类器官的构建
构建心脏类器官旨在体外重现心脏的基本结构与功能，其核心策略是利用人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）定向分化/分化的心脏谱系细胞自组装或结合生物材料，促使以心肌细胞为主，成纤维细胞、内皮细胞等间质细胞为辅的细胞群在三维空间内紧密连接、规律性排列，实现由单组分心肌细胞向多组分心肌组织的跨越，进而形成组织级别的心肌与腔室结构，并兼具机械收缩与电信号传导特性，在体外模拟人类心脏早期发育过程和心脏的基本结构与功能。
1.构建心脏类器官的细胞类型
成年人源心脏细胞的获取极其困难，主要原因为缺乏成体人心脏供体、人成体原代心肌细胞分离技术难度极高、体外长期维持成体心肌细胞存活和功能的培养方案尚未成熟。因此，用于心脏类器官构建的心脏谱系细胞多来源于干细胞分化或是分离的动物原代心脏细胞（图8-2）。
图8-2 心脏类器官构建的细胞来源
人PS细胞（hPSCs）分化得到的心脏细胞和体外酶法分离得到的新生大鼠心脏细胞是用于构建心脏类器官的两种主要细胞来源。（a）人PS细胞主要包括人ES细胞（hESCs）和人iPS细胞（hiPSCs），人ES细胞来源于人胚胎囊胚期的内细胞团，人iPS细胞可在体外由成纤维细胞等重编程获得；（b）人ES细胞和人PS细胞在体外进行扩增培养；（c）人PS细胞在小分子的分步定向诱导下可获得心肌细胞和其他心脏细胞用于心脏类器官的构建；（d）新生大鼠心脏分离消化获得心脏细胞
（1）干细胞
①hPSCs
hPSCs包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）和人诱导性多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。这些细胞既可以在体外长期扩增、传代；也可以被诱导分化为来自三个胚层的各种组织细胞，如神经细胞、心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞等。
hPSCs可以在体外分步诱导分化为中胚层细胞、侧板中胚层细胞、心脏前体细胞及心肌细胞。hPSCs分化为心肌细胞的诱导效率可达90%，并且分化的心肌细胞具有典型的心肌细胞特有的钙瞬变、动作电位、节律性收缩特征和对交感神经、迷走神经及药物的反应性［6-9］。hPSCs分化获得的心肌细胞成熟度仅相当于胚胎期心肌细胞，并且存在成熟度非均一性和不同心肌细胞亚型。采用不同的诱导方案，hPSCs可被诱导分化为非心肌细胞，如心脏成纤维细胞［10］、内皮细胞［11］、平滑肌细胞［12］及心外膜细胞［13］等多种心脏相关细胞类型（图8-3）。这些细胞与心肌细胞交互作用并自组装形成心脏类器官。有研究显示，利用心肌细胞占比65%～75%的混合细胞进行类器官制备时，可以获取最佳的心肌条类器官收缩力性能［14］。
图8-3 hPSCs分化的心脏谱系细胞
人多能干细胞来源的心肌谱系细胞：（a）内皮细胞，CD31，内皮细胞标志物；（b）平滑肌细胞，α-SMA、Calponin，平滑肌细胞标志物；（c）心肌细胞，CTNT，心肌细胞标志物；（d）心外膜细胞，WT1、ZO-1、TBX18，心外膜细胞标志物；（e）成纤维细胞，Vimentin、DDR2，成纤维细胞标志物
②间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）
MSCs是一种来源广泛的成体干细胞，最早于1966年在骨髓中发现，之后进一步发现其可以从脐带、脐带血、脂肪组织、血管壁等组织分离获得。MSCs具有一定的自我更新和分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等，具有来源广泛、易于分离扩增、免疫原性低的优点。MSCs具有较强的旁分泌能力，其分泌的多种细胞因子具有免疫调控、促进细胞存活和血管新生的作用。这些特点有助于MSCs作为支持细胞参与心脏类器官的构建，调节心脏类器官内环境的稳态、促进长期存活和功能维持［15］。
（2）动物原代细胞
动物心脏分离的原代心脏相关细胞也可以用于构建心脏类器官。其中，最为常用的是新生大鼠心脏来源的原代心脏相关细胞。取出的新生大鼠心脏被均匀地切碎并置于包含胶原酶加胰酶的消化液中进行消化、分离，可获取包括心肌细胞、心脏成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等在内的多种心肌组织细胞类型［16］。由此获取的混合细胞类型，既可以直接用于构建心脏类器官，也可以通过差速贴壁的方法去除部分非心肌细胞，构建包含不同比例心肌细胞的心脏类器官。新生大鼠心肌分离的方法简便、快速、低成本，可以为体外细胞实验或类器官实验在短期内提供大量的细胞来源，缺点为各批次间细胞类型的占比不稳定、细胞再增殖与分化能力差、消化过程可能导致心肌细胞功能丧失或受损。但是作为一种简单易用的细胞获取方案，动物原代心肌细胞适用于类器官构建、培养、功能检测体系的测试。
2.心脏类器官构建方法
心脏类器官可以看作是具有类似心脏组织结构的功能单元。心脏类器官的构建根据起始细胞的不同可以分为从干细胞阶段起始的构建和从组织细胞起始的构建两类。根据构建的心脏类器官形态，可以分为心肌团类器官、心肌组织条类器官、心肌补片类器官等。不同的心脏类器官在细胞组成、结构和功能参数上具有很大差异（表8-1）。其构建的方法与不同的应用目的相关。
（1）基于图案化表面的心脏类器官构建
利用微纳加工的方式，可以构建图案化的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）表面，利用印章转印的方式将基质蛋白转印到培养皿的表面，形成图案化的细胞贴附区域，帮助心肌细胞在培养皿表面贴附成不同长宽比的长方形或者条形。研究表明，8∶1到9∶1的长宽比可以帮助分离的新生大鼠心室肌细胞获得最佳的成熟结构［26］。利用类似方案，可以将心肌细胞直接接种至具有沟槽图案化的PDMS薄膜表面（图8-4）。一方面，柔软的材料表面给心肌细胞提供更加类似于生理环境的培养表面刚度；另一方面，沟槽结构可以引导心肌细胞在PDMS表面形成取向结构。心肌细胞在取向化的柔软表面上形成同向排列结构，在电刺激或自发收缩的情况下，心肌表层的收缩带动PDMS薄膜的收缩，其收缩的幅度和心肌的收缩力直接相关。利用此原理，Kevin Kit Parker实验室［27］构建了第一代心脏器官芯片模型。他们还利用相似的原理，将心肌细胞贴附在类似鳐鱼或机器鱼的材料表层，由心肌细胞收缩带动软体机器鱼在培养基中游动［28］。在随后发展中，多种新技术为该模型添加了新的特征和属性。例如在心肌细胞中构建光敏通道，进行光控以减少电刺激对细胞的损伤［29］；利用附加结构色属性的明胶代替PDMS从而提高体系灵敏度［30］；利用3D凝胶打印来代替微纳加工提高体系制备通量［31］等。同时，因为PDMS多孔的药物吸附特征，越来越多的图案化PDMS被明胶替代。
基于图案化表面的心脏类器官制备方式能够直观地表征心肌的收缩力大小，但是受限于材料的性质，基于图案化表面的心脏类器官体系，只能用于检测心肌的频率负荷或药物负荷，而无法进行实际的等长拉伸或等比拉伸。
表8-1 不同心脏类器官的细胞组成及功能参数(https://www.daowen.com)
（续表）
注：本表为参考文献［25］文中表8.1的修改补充
APD：action potential duration，动作电位持续时间；SR：sarcoplasmic reticulum，肌浆网
图8-4 基于图案化表面的心脏类器官构建
（a）利用微纳加工的方法，在硅晶片表面形成凹槽，PDMS进行倒模；（b）得到带图案化的PDMS，利用图案化PDMS制备含有图案化表面的水凝胶；（c）细胞可以在带有凹槽的水凝胶表面取向生长，形成同向排列的结构；（d），（e）心肌细胞收缩引起图案化薄膜弯曲；（f）利用结构色水凝胶来制备图案化薄膜，则薄膜弯曲时会同时产生幅度及颜色的变化
（2）基于心肌组织条的心脏类器官构建
心肌组织条的制备和构建得益于心肌良好的自组装性能。将心肌细胞和成纤维、内皮、平滑肌或间质等细胞以一定比例混合之后，和胶原或纤维蛋白原等天然水凝胶预混并加入具有应力导向的成膜体系，心肌及其附属细胞在1～3天内，会逐渐在凝胶内部形成无支架的心肌组织条。在心肌组织重塑过程中，成纤维细胞等非心肌细胞对于组织的自组装起着至关重要的作用。体外构建的心肌组织条有各种不同形状，主要包括：①两端固着于尼龙纸框、可形变纤维、PDMS柱等上的心肌组织条［32，33］；②中间包含丝线或导线的心肌Bio-wire［21，34］；③包含或不包含网状心肌束的心肌组织网状贴片［14］；④心肌组织环［35］等。体外构建的心肌组织条大小各异，边长从约200μm到最大5cm不等。
根据心肌组织条形态和大小的不同，其收缩力检测方式也不尽相同。主要的方式包含视频分析和直接收缩力测定。在视频分析方法中，根据分析拍摄的心肌组织条在收缩过程中带来的偏移量来推算心肌组织条收缩力的大小，该方法的优点在于自动化程度高，可以进行高通量的分析和检测。但是缺点在于不能产生等长或等距拉伸情况下的心肌负荷测试。直接收缩力的测试体系通常包括高精度的力学传感器、数控单轴拉伸装置、生理及温度维持装置。利用这样的系统，可以实现心肌组织条在药物刺激、遗传操作或频率干预情况下同步检测其主动收缩力。同时，单轴拉伸装置可以对组织条进行等比或等长的拉伸，通过检测收缩力的增量，获得的主动收缩力参数可用于评价心肌组织条的功能成熟情况，被动收缩力参数则用于评价组织条本身的硬度和弹性等力学性能（图8-5）。
图8-5 基于心肌组织条的心脏类器官构建
（a）将纸框固定在PDMS凹槽中，加入细胞凝胶混合物，待其凝固后从PDMS上脱落形成结构均一的心肌组织条；（b）心肌组织条的HE染色；（c）利用自组装的拉力测试系统检测心肌组织条的收缩力；（d）心肌组织条在自发及电刺激下的力学变化；（e）心肌组织条在电刺激下逐步拉伸的力学变化峰图；（f）两端悬挂于PDMS柱的心肌组织条；（g）通过测量两端PDMS柱的位移间接得到的力学峰图；（h）两端悬挂于PDMS柱的心肌组织条批量化培养
基于心肌组织条的心脏类器官使得心肌细胞在组织内能够呈取向分布，一方面有助于心肌微组织力学性能的提升，另一方面也为体外检测心肌组织的电信号传导提供了基础。膜电位及钙离子相关的标测探针可以实时显示电信号或钙信号在心肌组织中的传导情况，荧光宽场标测系统和高速相机相结合则可以对心肌微组织电信号的传递情况进行实时记录，并用于后续传导速率及均一性分析。如何通过血管化进一步增加心肌组织条或块的厚度和构建类似在体心肌纤维的三层走向，不仅对维持和研究心肌组织的功能调控至关重要，而且可拓展类心肌组织的应用价值，如血管分泌因子与心肌细胞的交互作用、各种营养物质和活性分子与药物等对心脏类器官的调控及构建用于修复心肌的类心肌组织。
（3）基于心腔类型的心脏类器官构建
随着类器官技术的普及，建立了多种器官组织的类器官体系，用于模拟器官组织的发生、发育、生理及病理状态。早在2001年，诱导小鼠ES细胞心肌细胞分化的类胚体（embryoid bodies，EBs）就采用了三维培养体系［36］。采用类似的方法，hPSCs形成的类胚体在仅添加血清的情况下可分化为具有自发搏动的细胞团［37］。在之后的近10年，以悬浮细胞团为基础的诱导方法被广泛用于体外制备心脏谱系细胞，但受限于分化过程中心肌细胞获取效率和稳定性，该分化方案逐渐被更有效的单层细胞诱导方案所取代。
近2年，多个研究组开发了从h PSCs直接分化制备心脏类器官的方法，获得跳动的心脏类器官。该方案产生的心脏类器官可以模拟心管形成、心腔特化、心外膜生成等心脏发育标志性事件［38-40］。单细胞转录组测定、细胞标志物检测、心肌电位分析发现，心腔类心脏类器官包含多种心脏谱系细胞，能够再现心脏特征性组织结构和心脏节律跳动。该系统是研究不同干预因素对人类心脏发育和结构重塑影响效应的重要工具。和其他类型心脏类器官体系相比，心腔类心脏类器官面临标准化制备方案缺失、细胞组分稳定性差、大尺寸仿真性不足的巨大挑战，但同时制备的简便性、电活动和收缩力全视频化分析特性也使得心腔类心脏类器官可以直接对接现有的高内涵筛选、成像平台，迅速成为构建心脏类器官的代表类型。
（4）基于3D生物打印或高通量方案制备心脏类器官
为了满足模拟和检测的需要，高通量、标准化、规模化地制备具有心肌功能属性的心脏类器官是本领域的重要问题。3D生物打印的方式理论上可以全面对接现有的所有心脏类器官类型。但受限于现有的技术体系，目前的3D生物打印方式所适用的心脏类器官类型还主要局限于基于图案化心脏类器官和心腔类的心脏类器官（图8-6）。
基于图案化的心脏类器官打印，主要是通过3D生物打印的方式，将生物3D水凝胶墨水打印成具有图案化或沟槽的柔软表面，心肌细胞在接种于表面之后，通过自身收缩来产生图案化表面的形变，从而判定心肌的收缩情况［41，42］。在该类体系中还可以通过3D生物打印方式，复合具有形变响应的可变电阻类材料，从而达成水凝胶图案化表面和传感器件的一次成型。
基于心脏腔室的心脏类器官打印在原理上和细胞团的打印方式相类似。主要通过数控打印材料进行断点式挤出，或微流控双液相实现细胞团水凝胶的交联等方式，配合可编程的操作平台，将心腔式类器官直接打印在培养皿或培养装置的底部［43，44］。
基于3D生物打印的方式高通量制备心脏类器官有着不可比拟的优势，尤其在进行大规模、标准化的类器官制备方面。随着对3D生物打印相关材料和打印工艺的进一步开发，高精度、高可控性、用户友好的生物3D生物打印方式将更有效地助推心脏类器官的体外高通量制备。