8.1.4 心脏类器官的应用
不同构建方式获得的心脏类器官有其自身的特点，其应用场景也存在差异。从hPSCs起始构建心脏类器官，需要在构建过程中，先利用hPSCs形成三维培养的细胞球，再将细胞球经过不同阶段的定向诱导，可形成节律性跳动的、带腔室的心脏类器官。这类心脏类器官，不仅可重现心脏谱系不同细胞类型在发育过程中细胞命运的转换，还能够模拟心脏在发育过程中腔室重构的过程和调控。从心脏谱系细胞起始的心脏类器官构建，则是先将多能干细胞进行体外定向诱导分化，获得心脏祖细胞，进而获得心脏谱系的心肌细胞、血管细胞、心外膜、心脏成纤维细胞等，再将获得的组织细胞类型按不同的比例混合进行类器官的构建。这样获得的类器官，细胞来源相对明确，能够形成高度特化和统一的心肌组织结构，多用于开展药效筛选、毒理及心肌功能和遗传性心脏病机制的深入研究。
1.模拟人类心脏早期发育及发育异常
心脏发育是哺乳动物胚胎早期发育的关键事件。哺乳类所有的器官都来源于最早的受精卵。在胚胎发育的过程中，包含着重要的生物学事件：既有从受精卵向祖细胞、祖细胞向不同谱系的细胞命运的转化，又包含着细胞的增殖和迁移，并且这些重要的生物学事件都具有细胞、区域和时间的特异性。因此，难以纯粹基于单一细胞体系模拟胚胎早期发育生物学事件。hPSCs来源的心脏类器官能够在一定程度上模拟心脏早期发育的关键生物学过程。一方面，hPSCs具有向三个胚层各个不同世系细胞分化的潜能；另一方面，心脏类器官所特有的组织器官样结构，可以帮助在体外模拟和重现不同细胞类型在不同区域的异质性分布和交互作用。
瑞士洛桑联邦理工学院生物工程研究所的Matthias Lütolf领导的研究团队［45］利用小鼠PSCs直接形成类器官模拟早期原肠发生和心脏特化的过程。该类器官模型不仅重现与体内发育相类似的体轴形成模式，而且模仿原肠胚心肌祖细胞的发生、中心管的特化以及第一和第二生心区的形成；心脏祖细胞特化并自发迁移，形成新月形区域，并产生可跳动的、具有类似心内膜结构的“心脏”。
采用这类方式构建的心脏类器官不仅是研究人类心脏早期发育的模型，而且也是研究人类心脏发育异常、先天性心脏病的模型。如分离hPSCs后，采取尖底板离心的方式形成具有相同大小的细胞聚集体，并通过小分子双向WNT通路诱导后，形成具有结构化的含腔室的心脏类器官。该方案产生的心脏类器官具有心内膜腔室，并包含心脏成纤维细胞和内皮细胞网络和外部心外膜组织，这些特征和发育过程中人类心脏高度一致。该方案获得的心脏类器官中心房和心室肌细胞约占70%，其余的则为非心肌细胞。利用该模型可研究复杂的代谢失调导致的先天性心脏发育异常，如对该心脏类器官进行高糖和高胰岛素处理模拟妊娠期糖尿病对胎儿心脏的影响。心脏类器官体积增加、脂质积累及代谢障碍，并伴有异常电活动增加，与妊娠期糖尿病诱导的胎儿心肌病预期表型一致［40］。类似的模型还被用于验证基因缺陷所导致的心脏发育异常。在NKX2-5（心脏发育的关键转录因子）基因敲除的心脏类器官中，可以观测到和小鼠模型中类似的心肌致密化不全表型［38］。
2.心脏疾病模型
心脏病包括先天性心脏病和后天性心脏病两种。先天性心脏病可能与遗传相关或与母亲在怀孕早期的疾病或服用药物有关；后天性心脏病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、风湿性心脏病、高血压性心脏病、肺源性心脏病、内分泌性心脏病、营养代谢性心脏病等。其中由不同病因引起心脏机械和电活动的异常，表现为心室不适当的肥厚或扩张的一组异质性心肌疾病称为心肌病，严重心肌病会引起心血管性死亡或进展性心衰。根据疾病是否有遗传性或家族性特征，可将临床上常见的心肌肥厚、扩张性心肌病、心衰、心律失常、糖尿病心肌病、风湿性心肌病等笼统分为家族性/遗传性心肌病和非家族性/非遗传性心肌病两大类。在遗传性心肌病中，根据遗传或突变导致的心肌细胞结构和功能异常的类型，又分为基于心肌细胞结构异常的心肌病、基于心肌细胞收缩功能异常的心肌病、基于心肌细胞传导功能异常的心肌病和基于心肌细胞代谢功能异常的心肌病等。在非遗传性的心肌病中，根据心肌细胞损伤的原因可以分为心肌缺血损伤导致的缺血性心肌病，以及心肌代谢异常导致的代谢性心肌病等。
临床上常见的心肌病可能会同时包含一种或多种不同类型的心肌细胞结构和（或）功能异常。但构建的心脏类器官模型往往侧重于单种心肌细胞功能异常。由此，可以用一种或多种心脏类器官对同一疾病进行模拟单因素和不同侧重点的模拟和分析。同一心脏类器官的模型也可以通过复合不同的致病因素，例如缺氧，以及药物、代谢物、炎症因子和应力刺激等模拟心肌病的非遗传诱导因素。具体举例见表8-2。
表8-2 不同心脏类器官疾病模型所模拟的临床表型及检测参数
（续表）
（续表）
注：TTNtv：truncating titin variants，截断型肌节蛋白；MYBPC3：myosin-binding protein C3，肌球蛋白结合蛋白C3；MYH7：myosin heavy chain 7，肌球蛋白重链7；DSP：desmoplakin，桥粒蛋白；RYR2：ryanodine receptor 2，雷诺丁受体2；NK X2-5：NK2 Homeobox 5，NK2同 源框5；CMs：cardiomyocytes，心 肌细胞；（H）CFs：（human）cardiac fibroblasts，心脏成纤维细胞；HCMECs：human cardiac microvascular endothelial cells，人心脏微血管内皮细胞；HUVECs：human umbilical vein endothelial cells，人脐静脉内皮细胞；h ADSCs：human adiposederived stem cells，人脂肪来源干细胞
（1）遗传性心肌病
①心肌细胞肌节结构异常导致的心肌病(https://www.daowen.com)
肌联蛋白（titin）基因截断突变（truncating titin variants，TTNtv）是扩张型心肌病最常见的遗传原因。利用含人TTNtv的PSCs来源的心肌细胞构建肌肉条形的心脏类器官，可以观测到明显的微组织收缩力功能受损，对应力拉伸和异丙肾上腺素刺激反应敏感度降低［32］。巴氏综合征是一种由TAZ基因突变，进而引起线粒体功能异常所导致的心肌病，其主要表型表现为心脏的扩张和心肌收缩力的下降。研究人员将含TAZ突变的hiPSCs来源的心肌细胞接种到图案化的PDMS薄膜上，心肌细胞在图案化的表面上取向排列，同向收缩并带动薄膜的卷曲。通过对薄膜卷曲程度的评估，可直观地验证心肌收缩力的变化。通过该模型，研究人员发现TAZ基因突变导致线粒体中外膜上心磷脂的分布和功能出现异常，使心肌细胞内活性氧ROS水平升高，进而破坏心肌细胞中的肌节结构，引起心肌收缩力下降；并证明基因回补和抗氧化治疗均能在一定程度恢复TAZ突变的心肌收缩功能［55］。
②心肌细胞电活动或传导功能异常导致的心肌病
心肌细胞电活动异常，例如QT间期的延长及钙稳态的异常会导致心律失常的发生，但不同基因突变导致的QT间期延长的特征和机制不一。因此，研究人员将心肌离子通道或钙稳态相关基因突变的hiPSCs诱导分化为携带相应突变基因的心肌细胞。通过对突变型心肌细胞电生理等活动的监测证明离子通道的电位变化、异常钙释放概率增加等相应的电活动或钙活动的异常。在基于细胞功能验证体系中，心律失常无法直接模拟，只能通过电活动或钙活动异常来间接反映，而心脏类器官则可在组织级别模拟相应的表型。
儿茶酚胺敏感性室性心动过速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT）是一种遗传性心律失常。通常CPVT的患者并没有明显的心脏结构异常，常规心电图检测也往往是正常的。但是在运动或情绪触发时，可能发生室性心动过速，严重的可导致死亡。研究人员将带有RYR2基因突变的心肌细胞接种在图案化的明胶表面，该基因突变是CPVT的形成原因之一。心肌细胞在图案化明胶表面呈取向排列，在正常心肌细胞形成的类器官中，其钙信号和电信号的传播也具有一致的方向。在提高刺激频率并激活儿茶酚胺情况下，带有RYR2基因突变的心脏类器官产生一定比例螺旋形的钙折返现象。这一结果证明心脏类器官可以在体外用于心律失常这一组织级别表型的模拟和机制分析，并且和心肌细胞结构导致的心肌病不同，心律失常的表型并不是研究传统遗传病时非此即彼的表型模式，而是表现为钙活动或动作电位出现的传播模式紊乱的概率［29］。
（2）非遗传性心肌病模型
心脏缺血/再灌注致心肌细胞死亡及损伤，最终导致心衰。将心脏类器官培养于无糖、含乳酸的酸性“缺血缓冲液”中，并暴露于低氧环境，用于模拟心肌缺血的状态，随后更换为普通的培养基并恢复正常的氧环境，用于模拟心肌缺血/再灌注损伤。和典型的缺血/再灌注表型一致，心脏类器官表现为组织中近50%的细胞死亡和显著的收缩功能下降［56］。在营养扩散梯度和慢性肾上腺素刺激的心脏类器官培养体系中，研究人员利用心脏类器官体积优势，将缺氧类器官的内部到边缘和梗死心脏的“梗死—交界—偏远区域”相对应，模拟了急性心肌梗死后的心脏结构重构和功能失调［60］。心脏类器官也可以解析心肌损伤时细胞类型特异的反应过程和调控，从而模拟心肌再生和纤维化的早期过程。在hPSCs定向诱导自组装的包含心肌细胞、内皮细胞或心外膜细胞及成纤维细胞的心脏类器官冷冻损伤模型，尽管心脏类器官仍然在收缩，在损伤部位可观察到严重的细胞坏死和少量的细胞凋亡，随后大量的细胞外基质堆积、纤连蛋白高表达和内皮细胞或心外膜细胞伴随着COL1A1＋成纤维细胞迁移入［40］。这个过程再现了在体心肌损伤的反应。
用0.001～1μmol/L去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）处理心脏类器官7天可导致心肌细胞肥大和死亡，用于模拟肥厚型心衰。与患者中观察到的表型类似，在心脏类器官中，NE刺激浓度依赖性地引起收缩功能障碍，并引起临床检测中常用的生物标志物NT-proBNP以浓度依赖性方式释放［35］。
3.药效及药毒性研究
受限于原有细胞模型对人类心脏发生、发育、组织功能特征、病变和药物研发模型的局限，以及模式动物和人类心脏的结构和功能差异，心脏类器官作为体外能够定制化构建、包含心脏复杂组织结构、具有心脏发育特征和组织功能及病理性改变的体系和患者与疾病的个体化特异性人类心肌模型，弥补了原有心肌细胞和动物模型用于药效分析和心脏毒性检测的不足。
利用聚乙二醇基板图案化构建的规模化类器官（直径为600μm）检测体系，基于收缩持续时间和舒张相关的参数，检测了包括阿莫西林、多西环素和沙利度胺在内的9种化合物对心脏发育过程中的潜在影响［61］。另一项工作中，则利用384孔圆底超低黏附板形成立体的心脏类器官检测了15种FDA批准的抗肿瘤、抗心律失常、抗真菌和抗精神病化合物，以及14种与结构性心脏毒性无关的临床化合物。采用形态学特征、生物标志物评估、高内涵生物学［线粒体膜电位（ΔΨm）和内质网（ER）完整性］和细胞活力测定（ATP耗竭）来评价化合物对心脏类器官功能的影响［62］。这是第一项基于人心脏体外模型，使用大量不同结构心脏毒性药物类别的多样化组合评估心脏功能的研究。
心脏类器官的模型也同样可以用于挖掘可能的促心肌再生或心肌病治疗药物。在一项研究中，为了挖掘促进心脏再生的候选药物，研究人员首先在细胞模型中以增殖为指标，从5 000个化合物中筛选到100个能够促进心肌增殖的候选化合物。随后，以3个浓度范围（0.1μM、1μM和10μM）在基于h PSCs构建的心脏类器官中进一步筛选，最终发现3个促进心肌增殖的化合物［63］。hPSCs经EBs再定向心肌细胞分化形成的人心脏类器官用于评估免疫抑制剂他克莫司（钙调磷酸酶抑制剂）和西罗莫司（m TORC1抑制剂）以及SB202190（一种选择性p38-MAPK抑制剂，作用于p38 2iα/β亚型）用于治疗TGF-β1引发的心肌纤维化的有效性［64］。
现有的抗肿瘤药物或抗病毒感染药物，在很大程度上可能造成心脏损伤。心脏类器官可以帮助筛选和评价可能的心脏保护剂。研究人员利用hPSCs来源的心肌细胞对常见的20余种抗病毒药物进行检测，发现阿匹莫德、瑞德西韦、利托那韦和洛匹那韦4种药物在临床相关浓度下可在一定程度上诱导细胞死亡、肌节紊乱以及钙处理和收缩失调。在此基础上，利用构建的人肌条心脏类器官对细胞模型筛选获取候选心肌保护剂进行功能评价［33］。
药物研发是一个耗时而又昂贵的过程，历经数十年、耗费近千亿才可能开发出有效药物。药物开发中断最常见的原因是化合物潜在的心脏毒性而导致的临床实验失败［65］。心脏类器官相比单层心肌细胞，除了具备与成体心肌更相近的动作电位持续时长、搏动频率、收缩力等功能特性，其不同细胞类型间的串扰及与细胞外基质的相互作用同样影响心肌细胞的功能状态。和平面培养的心肌细胞相比，包含微血管网络的心脏微器官能更加准确地预测药物的有效浓度与安全剂量上限。如在高浓度阿夫唑嗪或托特罗定处理下观察到的心脏类器官QT间期增长，这与临床上两种药物产生的不良反应现象一致，基于心脏类器官振幅判断的特罗地林临界使用浓度（2.6μM）也与临床血浆毒性浓度（2.1μM）相近［66］。
4.促进心肌损伤修复与再生
成体心肌细胞年再生率不足1%且随年龄的上升不断下降，心肌细胞一旦死亡，其所在受损区域被非功能化的纤维瘢痕填充，最终将造成心肌永久性损伤甚至心衰。心脏类器官具备多细胞类型组成、心脏类似组织结构、心肌组织功能，可以用于模拟心肌病理性重塑过程，进而探究心肌损伤修复的发病机理。在包含腔状结构的心脏类器官模型中，研究人员发现冷冻损伤会诱导心脏类器官产生区域性的细胞凋亡，并激活COL1A1＋成纤维细胞与心外膜样成纤维细胞向损伤部位的快速聚集，进而沉积细胞外基质修复受损心肌。“心肌补片”型心脏类器官则可以在模拟心肌损伤修复结构性重塑的基础上，再现心肌电传导功能的重塑［67］。
除用于损伤修复模型开发外，心脏类器官还可作为移植物直接参与受损心肌的原位修复，其中具代表性的工作是基于纤维蛋白原水凝胶体系开发的片状心脏类器官经原位移植后可被宿主血管化，成功修复了豚鼠的心脏损伤、改善了左心室功能［68］。猪心梗模型心外膜移植这类补片及3D生物打印的由h PSCs分化的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞构成的三维心肌补片被证明是促进心梗后心脏功能的改选，展现出良好的临床转化应用前景［69，70］。尚无证据表明心肌补片在移植后会诱发宿主心律失常，但这有可能是其与宿主心肌的功能耦合不足。因此，如何促进心脏类器官与宿主心肌的低免疫原性耦合与功能性同步，是其用于心肌修复所需解决的重要问题。