8.2.2 血管类器官的构建
1.构建血管类器官的细胞类型
血管类器官的构建是对天然血管组分的模拟，其中用于构建血管类器官的细胞类型与天然血管细胞类似，主要为血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞及成纤维细胞，主要来源于原代血管细胞和h PSCs分化的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）和血管细胞。近年来，血管及血管相关细胞已成为构建血管类器官的主要细胞来源。
（1）原代血管细胞
血管细胞可来自自体血管壁分离的原代细胞。自体来源的血管壁分离的细胞具备更好的生物相容性及更成熟的细胞功能特征。然而，终末分化人体细胞材料来源有限，大规模制备难度较高，而且不同人来源的组织和分离批次之间细胞存在异质性。
①内皮细胞
内皮细胞是构建血管类器官及血管组织工程中十分重要的种子细胞。常用的内皮细胞为人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），也有采用外周血来源的内皮细胞（blood—derived endothelial cells or blood outgrowth endothelial cells，BOECs）或内皮祖细胞。间皮细胞（mesothelial cells）也可替代内皮细胞。
②血管平滑肌细胞和成纤维细胞
血管平滑肌细胞和成纤维细胞是血管中膜、外膜中细胞外基质的分泌来源。正常成熟血管中的平滑肌细胞常为收缩型，细胞浆中大部分为收缩装置所占有，增殖能力较弱。在体外培养时，收缩型血管平滑肌细胞有可能转变为合成型。但取自人大隐静脉的血管平滑肌细胞具有良好的生物学功能和增殖能力，可作为种子细胞的来源。人成纤维细胞相对容易获得，并具备较强的增殖能力［71］。
（2）干细胞及其衍生的血管细胞
干细胞包括多能干细胞及成体干细胞，是具有自我更新及分化潜能的细胞，但后者的自我更新及分化潜能远不如PSCs。干细胞的特性使其更具备标准化及产业化的潜力。
①hPSCs及其分化的血管细胞
hPSCs包括人ESCs与hiPSCs，具备近乎无限体外扩增能力及向内皮细胞［11］、血管平滑肌细胞［12］、血管周细胞［73］、成纤维细胞［10］等定向诱导分化能力，是构建血管的优秀种子细胞来源。诱导hPSCs分化为血管细胞的方法基于人们对血管细胞发育中关键调节信号的认识，通过体外模拟血管发育信号，辅以特定细胞的纯化方法，诱导h PSCs分化获得内皮祖细胞及高纯度各种血管相关细胞。由hPSCs分化获得的血管相关细胞具有血管细胞的形态和功能。因此，可利用这些细胞组装人血管类器官，也可以利用血管诱导分化信号直接调控h PSCs，自组装构建人血管类器官［12，73-75］。但由hPSCs分化的血管细胞在不同hPSCs分化的各类细胞比例和批次之间有差异，在功能、代谢和生物特性等方面欠成熟，其诱导分化方法和促进成熟的手段还有待进一步优化。
②成体干细胞及其分化的血管相关细胞
成体干细胞是存在于已分化组织中的相对未分化的细胞，具有一定的自我更新能力。利用成体干细胞表面标志物将其富集，在一定条件下可分化。其中，MSCs是一类被广泛研究及应用的成体干细胞。MSCs易于获取，如可以从脐带、骨髓、脂肪等组织中进行分离，具较强的增殖能力，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等。除了分化能力，MSCs还具备较强大的旁分泌作用，如分泌的可溶性细胞因子具有调节免疫细胞的作用，分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进血管新生、发挥促进组织修复的功能。以上特征使得MSCs成为备受关注的血管类器官构建细胞。
内皮祖细胞具有体外分化为功能性内皮细胞的能力，最早是从外周血中分离出来的CD34＋/FLK＋细胞。内皮祖细胞来源于骨髓，受到VEGF、血管损伤或其他因素刺激后进入血液。然而，内皮祖细胞在血液中含量很低，获取难度较大。随着hPSCs分化技术的发展，现可利用hPSCs获得内皮祖细胞。利用hPSCs获取成体干细胞有可能取代人自体血管壁细胞，成为构建血管类器的主要细胞供源。
2.血管类器官构建方法
血管类器官构建的关键是获得血管细胞等基本构件和形成可灌流的血管网络。目前血管类器官主要采用自组装和组织工程手段构建，前者通过hPSCs定向诱导分化或血管细胞的共培养获得自组装血管类器官，后者利用天然血管脱细胞和再细胞化或3D生物打印进行构建（图8-8）。
图8-8 血管类器官构建方法示意图
血管类器官构建主要有2种策略：hPSCs定向诱导血管细胞分化或血管细胞共培养获得自组装血管类器官和利用天然血管脱细胞和再细胞化进行构建。
（1）自组装构建
哺乳动物的血管生成包括血管发生（vasculogenesis）与血管新生（angiogenesis）。血管发生指从胚胎发育时中胚层细胞分化至血管细胞并形成原始血管的过程，其形成于心脏开始收缩之前，是血管从无到有的生物学过程；血管新生指从已有的血管基础上通过内皮细胞的增殖、分化和迁移，以芽生或非芽生的形式生成新生血管，是血管从少到多的生物学过程。尽管血管由3层组织构成，但绝大多数血管发育学说将血管内膜或内层作为研究重点。在人胚胎发育第15～16天，卵黄囊处的胚外中胚层内的间质细胞特化形成细胞团，称为血岛（blood island）。血岛内包含造血干细胞，外侧细胞形成成血管细胞（angioblast），即最初的内皮细胞。由内皮细胞围成的管道即为原始血管，中间的造血干细胞也在血管内分化为原始红细胞。原始血管在胚外组织中不断延伸融合，形成胚外血管网。胚内血管发生晚于胚外血管，约在胚胎第18～20天，由中胚层来源的成血管细胞分化为内皮，并进一步组成血管网络。与胚外血管发生不同，胚内血管发生不伴随管内血细胞发育。在胚胎第3周末，胚内及胚外血管网络开始相互联通，同时原始心管也已发育并开始跳动，血液循环由此开始。血管内皮细胞形成管腔后，进一步招募外周细胞稳定血管。不同功能血管中的内皮细胞在信号分子及血流刺激下发生特化，以适应不同组织器官的需求。如NR2F2通过抑制NOTCH信号通路促进静脉内皮细胞分化，而NOTCH可以通过FOXC、SOXF家族的转录因子促进动脉内皮细胞分化。血管平滑肌细胞是血管的重要构成组分。血管平滑肌细胞与弹性纤维层交替构成血管中膜，在神经递质、激素和代谢产物调节下通过收缩和舒张调节血压及血液分布；血管平滑肌细胞可大量分泌弹性纤维等细胞外基质，对血管结构进行稳定。成纤维细胞主要分布于血管外膜，通过分泌胞外基质（如胶原等），增加血管机械强度；成纤维细胞也可通过分泌血管上皮生长因子等促进血管新生。在机体内复杂的生物、物理、化学信号的影响下，血管系统伴随机体发育逐渐成熟。已形成的血管网络是经过多次的修整后定形的最佳状态。血流并不参与初始血管的生长，但对脉管系统的成熟重塑有重要作用，决定血管的保留和退化。例如，无血流灌注的血管将逐渐退化消失［71，72］。
基于自组装的血管类器官模拟了血管发生和早期发育过程。构成血管的主要细胞来自中胚层，因此利用hPSCs经中胚层分化的多血管谱系细胞可自发组装成三维相互连接的血管样网络。采用此策略，Reiner Wimmer等［74，76］首次通过阶段性诱导h PSCs球培育出人类3D血管类器官。将hPSCs球包裹在Ⅰ型胶原-基质胶中经中胚层前体细胞分化和进一步生长，自组装形成含内皮细胞和周细胞且具有基底膜包裹的复杂微血管网络。这些3D血管类器官具有人类微血管的形态、功能和分子特征，单个的血管类器官可在96孔培养皿中长期维持；移植到免疫缺陷小鼠肾包膜后，人血管类器官能够和小鼠循环系统长期联通，特化成功能性的动脉、小动脉和静脉，并有血液灌注。
自组装的另一种策略是采用血管细胞及支持细胞等构建血管类器官。hPSCs诱导分化的血管祖细胞和各种血管细胞可为获得结构较稳定的血管提供充足的供源。如Sravanti Kusuma等［77］和Thomas Colunga等［78］分别利用hPSCs诱导分化的具备形成内皮与周细胞分化能力的早期血管细胞（early vascular cells，EVCs）或血管前体细胞在水凝胶中或血管支架上自组装形成由内皮细胞、周细胞构成的微血管网络或由内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞等构成的血管，植入小鼠中可与小鼠血管网整合，并有血流通过。
基于hPSCs来源的血管细胞自组装策略构建血管类器官方法简便、高效、在体外可形成人微血管网络。主要不足是可重复性、可扩展性差和无灌注。由于不同hPSCs系和分化的细胞存在异质性，单纯采用自组装体系构建的血管类器官在结构功能之间存在较大的差异，难以建立高通量的均一血管类器官以满足应用需求。此外，获得的血管类器官仍只是血管雏形，尺寸较小（1～2 mm），为封闭式的无灌注脉管，在体外难以维持长期稳定和满足功能需求。因此，如何在此体系中提升目标细胞的分化效率、各组分比例可控性和功能成熟度以获得均一、成熟、体外可灌流的血管类器官并规模化是有待解决的瓶颈问题。此外，如何对自组装血管类器官进行质量评价也是其走向应用的关键，需要进一步研究合理的质控指标、量化方法及评价体系。
（2）组织工程化技术构建血管类器官(https://www.daowen.com)
血管类器官构建的另一种方法是采用组织工程化技术，借助天然细胞外基质材料或合成生物材料构建生物支架，细胞再灌注获得血管类器官。这种方法获得的组织工程血管结构更稳定，可以体外长期培养，血管功能成熟，实现屏障和灌流功能。主要策略有脱细胞和再细胞化、生物打印及血管类器官芯片。
①脱细胞和再细胞化
原生器官的血管具有复杂的空间结构，这是维持器官特异性功能的重要基础。采用从器官脱细胞的方法，得以保留细胞外基质和特异的血管骨架网络，利用此作为血管的生物支架再植入内皮细胞和其他血管特异的细胞，从而获得具有血管组分和血管特异结构的类器官。例如，利用小鼠肝脏去除组织中的细胞成分，保留细胞外基质成分和完整的血管网络，再灌注HUVECs，可形成血管丛［79］。但单纯的内皮血管壁相对单薄，容易出现泄露。进一步，Thomas Colunga等［78］采用源于hPSCs的血管前体细胞灌注到脱细胞血管支架，其分化的内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞和基质细胞组装成具有内皮细胞排列的毛细血管网以及被平滑肌细胞支撑的血管，形成不同直径且具有良好灌流功能的血管网，并具有内皮屏障功能。这种方法可以保留血管组织的原始细胞外基质成分和信号分子，有利于血管细胞贴附和生长，但植入的细胞是否能均匀地贴附于管腔还有待研究。
②生物打印
近年3D生物打印血管类器官快速发展。3D生物打印可以精确模拟原生血管网络或设计个性化复杂血管网络结构，快速稳定地重现大血管的管腔结构和毛细血管精细复杂的空间结构。生物打印按打印的方式可以分为挤压生物打印、喷墨生物打印和光辅助生物打印（包括基于数字光处理和基于激光的生物打印），也可以简单分为直接生物打印和间接生物打印。直接打印主要通过连续的层叠方式，用负载细胞或细胞兼容的生物墨水制造血管床，如常用于构建空心管腔的同轴打印，可获得独立的血管结构。间接打印主要利用可牺牲材料在组织构造中制造可灌注血管通道，再利用内皮细胞灌注或内皮细胞出芽获得血管网。上面提到的生物打印技术都可用于间接打印，以常见的挤压打印为例，可以用两种不同水凝胶，一种作为支撑建模材料，一种作为牺牲材料。研究者利用具有热响应的Pluronic F127水凝胶在4℃低温情况下会液化流出的特性，在Gel MA水凝胶中留下空心通道。但这种消融技术会导致结构欠稳定，尤其是打印尺寸稍大的组织。为了维持和加固经过内部消减的打印组织，研究者开发了“FRESH”的新技术，利用光固化基质材料短时间曝光进行部分交联来支持牺牲材料，从而减少水凝胶的变形。例如，选择明胶作为热可逆支撑液，维持由海藻酸盐、纤维蛋白和Ⅰ型胶原等水凝胶组成的打印结构，显著提高了打印的复杂中空结构保真度和稳定性。直接打印和间接打印各有利弊，直接打印可精确控制细胞位置，打印细胞的同时，完成结构的设计。间接打印可以制造复杂的血管结构，但难以精确控制细胞定位。可以通过多种方法组合打印复杂多级血管结构，例如，直接打印可以控制细胞的精确定位，形成微米级的毛细管网络，而间接打印可以为细胞黏附提供定制的通道，产生毫米大小的血管［80］。
3D生物打印可精确控制细胞、生物材料和生物活性因子的空间排布，并且方便、自动，是构建复杂结构类器官的有效手段，但各种方法在精度、尺寸限制和建造成本等方面均各有所长和不足，目前还没有单一的解决方案可以完全解决类器官血管化问题。但不同技术的优势互补为构建长期维持功能的血管类器官提供了可能。3D生物打印虽然可以在微米尺度有序排列细胞和细胞外基质，但难以兼顾打印后细胞的生长和功能、存在去除材料与细胞融合之间空管、构建多级血管网等难题。因此，有待进一步开发可牺牲生物墨水和多孔生物墨水，为细胞生长微环境提供空间，并兼顾复杂结构打印与细胞功能的表达；同时，精准开发个性化3D生物打印工艺以实现血管化心脏的结构与功能仿真。
③血管类器官芯片
血管类器官芯片主要有2种类型：一种是基于微流控的血管膜。微流控与可机械收缩的血管膜结合模拟血管和界面两侧的组织互作和器官水平血管的功能。例如常见的肺器官芯片［81］、血脑屏障芯片［82］等。另一种是基于血管细胞自组装的微血管类器官芯片：利用微通道中基质胶封装的血管细胞自组装形成血管网，该血管网的形成可以和生长因子梯度诱导、微流控灌注相叠加。例如，用于研究肿瘤血管浸润的芯片［83］、血管发生的芯片［84］、免疫细胞迁移的芯片［85］等。此外，利用软光刻技术可以制造图案化的通道，用来构建血管芯片。控制几何形状、生化浓度梯度和机械刺激（例如剪切流和间隙流），可以更接近地模拟体内血管的实际形貌及所面临的物理、化学条件刺激。
血管类器官芯片的优势在于易于批量制备、成本低和便于观察。但是，由于血管类器官芯片中血管界面及血管网络均只能用于测试，很难取出，因此只能用于模型的制备而不能用于再生医学的血管网生产［86］。
3.血管化心脏类器官构建策略
血管的主要功能是为组织提供持续的营养物质和氧，并运走代谢废物。心肌是高度血管化的组织，可满足其大量消耗养料和氧的需求，因此，在心脏类器官中构建具有灌注功能的血管不仅是维持心脏类器官结构和生理功能的基础，也是构建一定尺度心脏类器官所必需的，同时血管化促进心脏类器官的成熟，并为研究人类心肌细胞和血管细胞与血液之间的互作提供体系。构建血管化心脏类器官的主要策略为诱导hPSCs共分化为心肌细胞与血管细胞自组装形成血管化心脏类器官［38］，及预制血管或心肌组织再组装形成血管化心脏类器官［87］。
（1）共分化构建血管化心脏类器官
心脏和血管细胞均来源于中胚层，因此，用于器官-血管细胞共分化方法也可以应用于构建血管化心脏类器官。基于此理念，Lika Drakhlis等［38］和Yonatan R.Lewis-Israeli等［40］通过小分子化合物或结合生长因子调控双向WNT通路直接诱导h PSCs形成复杂的、高度结构化的三维心脏类器官，心肌层伴有内皮样细胞，其转录谱、结构和细胞类似于同期的胎心组织，具有内腔和多种心脏细胞类型，再现了心区形成、房室特化、复杂脉管网络和功能活性。此外，用生长因子BMP4和激活素A处理的心脏类器官显示出由hPSCs产生的内皮细胞数量增加，并可诱导进一步的血管生长。进一步，Pablo Hofbauer等［39］通过调控WNT-BMP信号轴构建了具有较大内腔的心脏类器官，并在心肌诱导过程中添加VEGF，强化了同时生成血管细胞的心脏类细胞和血管化心脏类器官的可行性。
共分化方法在体外构建人类发育早期心血管类器官中具有独特优势，但存在着可变性和复杂性较高的局限，并在体外难以实现灌流。因此，进一步深入解析人类心血管发生、发育调控的精细机制和开发高选择性的小分子化合物，将有助于在构建血管化心脏类器官各环节中更精准、有效地调控关键信号分子，提升构建的各类器官之间的均一性、复杂性和功能成熟度。
（2）预制血管或心肌组织再组装
在心脏类器官构建可实现灌注功能的血管才具有真正意义。为实现此目标，主要有如下的几种构建策略在探索中。
①血管细胞和生物材料预制血管
利用血管细胞和生物材料预制血管后再植入心肌细胞。如Mani T.Valarmathi等［15］利用hPSCs分化的心脏微血管内皮细胞和MSCs共培养到三维胶原载体生成的预血管化支架，在分化成熟并形成丰富微血管丛后再与心肌细胞及MSCs共培养获得含毛细血管网和具有管腔的心脏类器官。
②利用天然血管组织构建血管床来侵入心肌微组织
从体内分离具有可连接动脉和静脉的血管网作为血管床，将其和体外培养的心肌细胞组织片、内皮细胞共培养，同时用生物反应器对血管网进行灌注，以维持血管网的支撑结构，可以在心肌组织片中形成体外可灌注的脉管系统。该方法虽然可以实现天然的血管网结构，但还无法实现高密度细胞接种，并且存在血管渗漏问题［88］。
③人工堆叠片层血管类器官封装到心肌微组织
利用可降解的合成聚合物打印拼接成中空的血管支架，支架表面通过软光刻技术制作图案，以促进内皮细胞贴附及生长。同时，在血管支架周围浇注充满心肌细胞的细胞基质，构建可实现部分灌注功能的血管化心脏类器官［89］。
④预制心肌细胞团或心肌微组织
在充满心肌细胞团的水凝胶中通过嵌入式三维生物打印的方式，可以打印由牺牲材料组成的血管网。之后，牺牲材料被洗脱，并灌注入内皮细胞，形成血管网。经过一段时间培养，水凝胶中的心肌细胞团会实现融合，并进一步形成同步跳动的血管化心脏类器官［90］。也可将hPSCs分化的早期血管细胞（EVCs）微球，通过3D生物打印到心肌组织中，自组装形成具有丰富毛细血管网的心脏类器官［91］。进一步，使用3D生物打印和热响应聚合物凝胶羟丁基壳聚糖制作凝胶框架用于控制细胞定向，利用hPSCs分化的心肌细胞和正常人心脏成纤维细胞制备细胞外基质纳米膜，并采用逐层堆叠打印将这些细胞植入定向凝胶框架中，制成定向控制的3D心肌组织，再与人心脏微血管内皮细胞共培养，可构建具有血管网络的定向的类似原生样三维心脏组织［92］。
尽管在心脏组织内工程化血管通道方面取得了巨大进展，但构建包含微尺度毛细血管和中尺度血管的多尺度血管网络仍然是一个巨大的挑战，微纳加工和3D生物打印技术提供了多种工具来生成预先设计的生物通道，从而能够组织和重塑血管细胞以形成中尺度血管，但维持整个血管类器官结构完整性和可灌注功能仍是研究的重点与难点［93］。