10.3.1　脑类器官的细胞类型

1.早期细胞类型特征

无论是哪种类型的脑类器官，目前的分化起始细胞主要还是多能干细胞（当然，也有少数以神经干细胞起始分化，或通过转分化策略实现3D培养的方案，我们在此就不做具体介绍）。伴随脑类器官分化的开展，细胞的多能干性消失，取而代之的是神经外胚层谱系特征。本章起始已经介绍了人大脑皮层的基本发育过程与细胞构成，发育良好的脑类器官，其细胞构成与此基本对应。比如，非定向分化脑类器官在早期（神经诱导3～5天后）［36］，可形成折叠为管状的神经上皮组织，其特征可由SOX2表达，及神经管顶侧（apical side）分布的紧密连接蛋白如ZO1来表征。与体内发育类似，神经上皮细胞在随后的分化过程中将转变为v RG，该细胞类型同样可由SOX2来表征，差异在于这些细胞进一步获得了胶质样特征（如开始表达胶质纤维酸性蛋白GFAP等），以及顶侧细胞连接形式由紧密连接转变为黏附连接。对早期培养的脑类器官，可对神经上皮、vRG的存在及结构特征进行鉴别。具体来说，对神经上皮的鉴定，主要时间段在诱导分化后数天至10多天（取决于分化方案的差异）；对于vRG的鉴定，一般在分化20天左右可检测到其产生。

此外，由于皮层源自端脑，表征端脑发育的特异标记物，如转录因子FOXG1、PAX6等，也可在早期阶段的非定向分化脑类器或皮质类器官中开始检测到广泛表达。实际上，端脑特异基因，尤其如FOXG1是用于鉴定端脑特异类器官，如皮质类器官、腹侧端脑类器官等必要的检测标准。而与皮质类器官仅分化产生FOXG1阳性的神经前体细胞不同，在非定向分化的脑类器官中，因其可能还含有中脑、后脑等其他谱系，往往还可能检测表达其他脑区特异基因的细胞（如中脑标记物FOXA2、后脑标记物KROX20等）。而对于其他脑区类器官而言，比如针对中脑类器官的分化，则需要在样本中富集中脑特异的前体细胞（比如FOXA2阳性细胞），尽量减少非中脑前体细胞（如FOXG1阳性细胞）的产生。这些早期的神经谱系、区域特征鉴定，可帮助对脑类器官的分化效率做出初步判断。

针对上述实验，目前对应的主要鉴定方式，或是对3D样本冷冻切片进行免疫荧光染色，或是将3D样本解离为单细胞悬液，重新铺板后对单层样本进行免疫荧光染色。这两种方法相比，前者能保留3D组织特征，但操作复杂度稍高且不便于定量分析，后者更易于细胞定量，但解离过程可能会对细胞样本产生损伤、筛选效应，因此需选择更适合具体需求的检测方案。

2.更成熟细胞的类型(https://www.daowen.com)

非定向分化脑类器官或皮质类器官中产生的v RG，在进一步培养过程中（30～40天），可分化产生中间前体细胞（标记为TBR2阳性）和新生神经元（标记为TBR1阳性、CTIP2阳性等），因此，脑类器官中的细胞类型复杂性开始展现出来。总体来看，在该阶段的脑类器官细胞构成仍以神经前体细胞为主，混以相对少量的新生神经元。继续培养后（2～3个月），神经元群体将经历扩增过程，体现为神经元总量与类型的增加。脑类器官中神经元的分化进程，总体与胚胎脑中神经分化类似，深层神经元（如CTIP2阳性细胞）先产生，浅层神经元（如SATB2阳性细胞）后产生。从神经递质类型上，模拟皮质发育的脑类器官中，主要生成以谷氨酸为递质的兴奋性神经元，以GABA为递质的抑制性神经元相对较少。而对于其他脑区特异类器，神经元的类型应主要与对应脑区的细胞类型一致，比如腹侧端脑类器官主要富集以GABA为递质的抑制性神经元。

同样，在分化后期（一般需2～3个月以上），脑类器官中会产生部分星型胶质细胞，其数量也会伴随脑类器官的成熟而提高。总体来看，脑类器官中胶质细胞产生的时间段会晚于神经元分化，这也与体内神经发育调控进程一致。除了星型胶质细胞，少突胶质细胞在现有的脑类器官培养中，即便经历长时间培养后也难以自发产生（特异模拟脊髓发育的类器官除外）；执行免疫功能的小胶质细胞也存在类似情况。因此，针对少突胶质细胞、小胶质细胞发育与功能的研究，还需要构建更复杂的多谱系脑类器官模型（详见前面的介绍）。除了成熟细胞类型的多样性，脑类器官中神经前体细胞构成也与人脑有类似之处。其中，大家最为关注的是人类皮层发育过程中大量扩增的o RG，这也是人脑发育与其他物种如啮齿动物相比关键的差异。体外培养2～3个月的非定向分化脑类器官或皮质类器官中，可呈现大量的oRG扩增。这些前体细胞的扩增，是脑类器官长期分化成熟的基础，同时，也为研究人类特有的oRG相关调控机制提供了重要的窗口。

关于脑类器官中的细胞类型，目前主要可通过免疫荧光染色进行鉴定。同时，由于与传统2D培养、2D分化相比，3D脑类器官细胞异质性更复杂，因此为更全面、细致展现细胞多样性及细胞谱系建立过程，近年来国际上开始应用多组学分析开展了大量相关研究，尤其包括单细胞水平的转录组分析。单细胞转录组技术的采用，为解析脑类器官细胞多样性、分化方案稳定性、样本间差异性等提供了丰富的信息［10，11，37，38］。基于单细胞的细胞类型定义，与染色鉴定验证相结合，可更可靠地理解脑类器官的发育特征。同时，从转录组水平比较脑类器官样本与脑组织样本，也是明确脑类器官与体内对应组织相似性的重要方法。在该领域，近年来也不断有新的数据分析方法建立，包括以可视化的方式展示脑类器官与特定脑区相似度的分析方案［39］。

当然，脑类器官与真实大脑的细胞构成方面仍存在一定差异。以模拟皮层发育的脑类器官为例，首先，上面提到的vRG、oRG、中间前体细胞、神经元等，其所占比例与体内脑组织可能并不完全相同；其次，在细胞亚类发育方面，比如同为皮层兴奋性神经元，不同位置（比如浅层、深层神经元）的皮层神经元间也存在形态、功能差异，而这些亚类的区分及对应数量如何在脑类器官中更真实呈现，也是待解决的难题。其他脑区类器官发育也会面临类似情况，比如中间神经元根据其形态、分子标记（如转录因子、神经肽）、电生理特征等，可分为许多亚类［40］，如何在腹侧端脑类器官中完整呈现不同亚类中间神经元分化，仍有待探索。其中，更好地维持脑类器官的长期、健康分化，比如整合功能性血管网络，或移植入体内发育，或是优化脑类器官发育，尤其是完善细胞亚类构建的重要策略［41］。