10.2.2 脑区特异类器官
上面提到的非定向分化脑类器官，在主要重现人脑皮层发育特征的同时，由于该构建策略并无分化引导步骤，在类器官中也可能随机出现与其他脑区相关的细胞谱系或组织结构。因此，非定向分化脑类器官更适合以宽泛地体外三维模拟人脑为目的的研究。另一方面，我们知道人脑是非常复杂的器官，不同的脑区、核团中细胞组分有异，并各自执行差异化的功能。对特定脑结构进行模拟、研究的需求，也推动了另一种脑类器官构建技术的建立——基于定向分化的脑区特异类器官。首个脑区特异类器官——皮质类器官于非定向分化脑类器官构建的同年（即2013年）成功建立［7］。随后，国际上多个团队针对包括皮层在内的多种脑区开展了类器官构建，快速推动了这一类脑类器官技术的发展。
我们上面介绍了由神经管发育出的初级脑泡——前脑、中脑、后脑——及其对应的衍生结构。目前，针对这些不同脑区的类器官模型均已陆续成功建立，为我们更精确地模拟特定人脑区域提供了新方法。其中，由于大脑皮层相对而言是大家最为关注的脑区，也是最早成功建立的脑区特异类器官模型，我们下面将主要以皮质类器官为例介绍其构建过程。
1.皮质类器官
皮质类器官与非定向分化脑类器官在构建流程上存在诸多共性，具体包括以下几个方面：①两种类型的类器官构建的基础，都是多能干细胞的增殖培养，因此，干细胞资源的质控很大程度上将决定脑类器官构建效率。②两种类型的类器官构建的起始步骤，都是3D拟胚体的制备，该策略的应用均与更早期开展的，基于拟胚体神经分化的探索有关［4］。③类器官长期的培养，均可整合旋转培养方式，从而更好地维持类器官样本中细胞的分化与成熟。下面我们重点针对几个差异化的步骤阐述皮质类器官的构建（图9-2）。
（1）干细胞的培养与拟胚体构建
该环节与上述非定向分化脑类器官对应步骤相同，便不再赘述。
（2）端脑诱导
该阶段是皮质类器官分化与非定向分化脑类器官分化过程的关键差异。由于皮质起源于神经管的前端区域（即端脑），拟胚体需在含有可诱导端脑特异谱系的培养液中生长、分化。其中的关键诱导因素，除了无血清培养条件外，主要还涉及TGF-β通路抑制剂、BMP通路抑制剂，以及WNT通路抑制剂的添加使用。其中，基于长期以来对神经诱导机制的研究，我们知道TGF-β和BMP通路是神经上皮诱导的负调控信号，因此抑制该通路将增强神经诱导效率。在实际分化操作中，研究人员通常会考虑至少阻断TGFβ信号，或同时将TGF-β、BMP信号阻断（该策略又称双SMAD抑制）。此外，由于从整个神经管前—后发育轴来看，WNT信号通路在神经管尾部激活，因此为进一步富集端脑特异的神经前体细胞，还可考虑对WNT信号通路进行抑制。在早期的皮质类器官分化探索中，研究人员即采用了TGF-β和WNT通路抑制策略［7］。历经该定向诱导处理后，拟胚体的分化方向将局限在端脑谱系。
（3）模式发生
上述处理过的样本在进一步的分化过程中，将自发模拟背侧端脑模式发生［8］，而背侧端脑即大脑皮层的发育起源。因此，对于皮质类器官的构建来说，模式发生阶段将不再需要进一步的诱导调控处理，维持拟胚体的正常分化生长即可。而对于端脑的其他区域分化而言，比如腹侧端脑分化，由于该区域发育与其他信号通路如SH H通路上调密切相关，则需针对性地激活SHH信号通路以实现腹侧模式发生引导，从而构建腹侧端脑类器官［9-11（］图10-2）。因此，总体来看，脑区特异类器官的构建需要贴近特定脑区的发育调控进程。(https://www.daowen.com)
皮质类器官与非定向分化脑类器官在构建上的另一关键差异，是皮质类器官方案可略过基质胶包被步骤。其替代方案可以是将基质胶以溶解状添加于培养液中，或者完全省去基质胶处理环节。这一变化降低了操作复杂度，有利于更大规模地制备脑类器官样本。
（4）长期成熟
皮质类器官的长期成熟条件总体与非定向分化脑类器官类似。早期的皮质类器官分化方案采用了静态培养方式，并通过定期对培养样本进行切割，以及提高培养箱中的氧气浓度，来避免脑类器官中心细胞的死亡；此外，溶解状基质胶的持续添加，也有助于皮层组织的结构发育［7］。2013年后，一系列皮质类器官构建方法先后建立［11-14］，这些方案基本遵循上述分化逻辑；在长期成熟阶段，水平摇床培养、基于迷你生物反应器的培养，以及常规培养环境下（非高氧环境）的静态培养均有采用。
通过以上的分化流程，即可建立特异性模拟人皮质发育的3D类器官模型。
2.其他脑区特异类器官
除了皮质类器官，其他脑区特异性类器官也在过去几年逐步被建立，包括腹侧端脑类器官［9-11］、脉络丛类器官［15］、纹状体类器官［16］、丘脑类器官［17］、下丘脑类器官［14，18］、中脑类器官［14，19］、小脑类器官［20］等，基本涵盖了神经管从前至后的主要脑区［图10-3（a）］。这些不同的脑区特异类器官的构建，都基于无血清拟胚体悬浮培养，因此，所需的基本流程、操作平台与上述非定向分化脑类器官或皮质类器官接近。其中的关键差异环节，是如何在神经诱导或模式发生阶段，重现特定脑区的发育调控。由于神经管的前—后轴和背—腹轴发育受到一系列形态发生因子调控，从而最终决定脑区分化命运，研究人员在体外类器官建模时的关键目的，即是模拟神经管特定区域形态发生因子的作用。比如，我们上面提到了皮质分化需要考虑抑制神经管尾部富集的WNT信号，而在构建偏尾部神经管分化时（比如丘脑），则需去除WNT抑制，并辅以可诱导尾部化的信号（比如胰岛素）［17］。又如，负责分泌脑脊液的脉络丛组织发育自端脑最背侧区域，而我们知道端脑背侧富集WNT与BMP信号（需注意WNT信号既存在前-后轴梯度，也存在背-腹轴梯度），因此，脉络丛类器官构建过程中，即是采用了在神经上皮形成后同时激活WNT和BMP信号通路的策略以促进背侧模式发生［15］。
图10-3 脑区特异类器官组装体构建
（a）代表性脑区特异类器官模型；（b）多脑区类器官模拟神经元迁移；（c）多脑区类器官模型模拟跨脑区环路发育
当然，我们在这里仅简要归纳了分化策略，在实际探索建立特定脑区类器官的过程中，往往需要经历大量、细致的条件筛选，才能明确最佳的分化方案。总之，以上多种脑区特异类器官的建立，进一步丰富了人脑体外3D模型工具盒，为研究脑区特异的生物学或病理过程提供了新的机遇。