11.2.3 内耳类器官的应用
内耳类器官可以在体外模拟耳蜗毛细胞的体外组织。随着探索的深入，已经可以从不同来源的干细胞诱导内耳类器官。内耳类器官具有与正常耳蜗上皮细胞相似的形态和功能，广泛应用于靶向药物的筛选与发现、进行疾病模型的构建并进行相应机制的探究、耳细胞的基因编辑与精准治疗，以及毛细胞再生医学与器官修复。
1.小分子药物筛选
耳毒性、保护性或再生化合物的药物通常在体外进行高通量筛选。来自小鼠耳蜗组织特异性祖细胞的类器官提供了一种研究毒性和再生的新工具。Will J.Mc Lean等［70］利用类器官，筛选了高效诱导毛细胞再生的小分子化合物的组合。Wnt通路激活剂CHIR99021、组蛋白脱乙酰酶抑制剂VPA能显著促进内耳类器官的扩增；2-磷酸-L-抗坏血酸（p Vc或P），一种稳定的维生素C形式和转化生长因子β（TGF-β）受体（ALK5）抑制剂616452能够进一步强化内耳干细胞的扩增效应。内耳类器官的培养还需要添加生长因子EFG、IGH和FGF，其中bFGF和CHIR99021对Lgr5+细胞培养最为关键。Notch通路的抑制剂LY411575的引入，能够使得扩增形成的类器官逐渐向毛细胞的命运进行分化。EGF受体家族成员ERBB2是不同组织中细胞周期进展的已知调节剂。通过化学或者遗传手段激活ERBB通路可诱导耳蜗支持细胞的增殖和毛细胞的分化［92］。在内耳类器官中，ErbB3结合蛋白抑制剂WS3和WS6与CHIR99021联合使用，显著促进Lgr5阳性内耳类器官的形成，但不影响毛细胞的分化［93］。G9a抑制剂BIX01294与CHIR99021联合使用可抑制内耳类器官的增殖［93］，但BIX01294联合LY411575和CHIR99021混合的类器官培养基可以强化毛细胞的分化［93］。在此基础上，为了发现促进毛细胞分化的新信号，Qing Liu等［94］在CHIR99021存在和LY411575不存在的情况下，利用来自Pou4f3（EGFP/+）小鼠的第二代耳蜗类器官筛选了1 004种美国食品和药物管理局批准的小分子，其中分化的毛细胞可以通过Pou4f3启动子驱动的EGFP的表达进行可靠标记。高通量筛选确定了91个促进毛细胞分化的候选分子，其中雷戈非尼在浓度为2 m M、5 m M和10 m M时，可促进毛细胞分化且重复性较好，其中5 m M雷戈拉非尼在毛细胞产生中表现出与LY411575存在的阳性对照组相当的分化效力，但高剂量的雷戈非尼（15 m M）似乎对耳蜗类器官表现出耳毒性。此外，与LY411575一样，雷戈非尼治疗也促进了诱导的毛细胞中突触前带的形成。因此，建立高通量耳蜗类器官筛查平台，对确定新的用于促进毛细胞分化和发育成熟小分子候选药意义重大。
Will J.Mc Lean等［95］利用耳蜗类器官模型成功比较了γ分泌酶抑制剂（gammasecretase inhibitor，GSI）在毛细胞再生实验中的有效性。为了实现GSI的并排比较，先进行耳蜗祖细胞扩张培养，再通过Wnt激活和Notch抑制协同作用分化出毛细胞。其中对大鼠的耳蜗类器官进行耳毒性测试，在第20天将类器官暴露于500μM西索米星2小时，再于第24天对类器官进行MYO7A和肌动蛋白的免疫染色，以未经处理的类器官作为对照。免疫染色结果表明，被西索米星处理过的耳蜗类器官有明显的细胞凋亡迹象，并且毛细胞亚群中可见碘化丙啶掺入；在第27天时，毛细胞存活数量仅为对照组的一半，说明西索米星对耳蜗类器官具有耳毒性。耳蜗类器官对西索米星的敏感性也验证了其分化出了功能性耳蜗毛细胞。此外，值得注意的是，CPD3作为一种新型GSI，对耳蜗类器官进行处理后，可以补充耳毒性试验中丢失的毛细胞数量［96］。
需要注意的是，类器官培养模型的在药物筛选方面存在一定局限性。由于已选择培养基成分最大化了干细胞的特征，在体外条件下获得的结果或许无法精确反映单一药物在体内完整器官中获得的变化。此外，由于来自整个耳蜗的支持细胞是在均质条件下进行分离、汇集并培养的，对于发生损伤或再生的细胞，耳蜗类器官无法得到精确的细胞类型和解剖结构信息。
2.耳聋模型构建与机制研究
内耳类器官为研究由遗传缺陷造成的听力损失提供了体外研究模型。TMPRSS3是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶，是哺乳动物正常听力所必需的，其突变会导致先天性和早发性听力损失。含TMPRSS3突变（TMPRSS3 Y260X）的内耳类器官能够经历正常的早期发育，但在培养第38天时，TMPRSS3 Y260X内耳类器官中出现毛细胞的退化和凋亡；同时Tmprss3敲除的内耳类器官中毛细胞BK离子通道也会减少，这与在体内小鼠前庭感觉上皮细胞的凋亡是一致的，说明小鼠胚胎干细胞来源的内耳类器官可以模拟体内基因突变相关的病理特征。Tmprss3敲除的内耳类器官scRNA-seq的结果表明内耳类器官可以作为Tmprss3敲除引起毛细胞变性的分子机制探究工具［97］。含特定基因突变的内耳类器官能够重现在体内观察到的遗传相关表型，表明类器官系统可以作为了解哺乳动物疾病遗传基础的强大工具。
GJB2编码缝隙连接蛋白26（connexin26，CX26），其突变会导致严重的人类非综合征性感音神经性听力损失。由于解剖学的限制，人耳蜗细胞不易进行活检。因此，ESCs/iPSCs是研究内耳病理学分子机制以及生成用于替代疗法的细胞的重要工具。为了建立针对GJB2相关听力损失的体外疾病模型，Ichiro Fukunaga等［98］将小鼠iPSCs诱导分化为CX26表达细胞，并且形成典型的耳蜗组织CX26间隙连接斑块（CX26-gap junction plaque，CX26-GJP）。这些由iPSCs诱导的CX26表达细胞表现出发育耳蜗典型的自发Ca2+瞬变，并且其Ca2+活动需要ATP和半通道（hemichannels）的参与，与正常发育耳蜗一致。此外，来自CX26缺陷小鼠的iPSCs的分化细胞也具有形成GJP的潜力；当诱导Gjb2敲除后，细胞内出现急剧碎裂的小囊泡样的GJPs，是GJB2相关听力损失的主要病理学特征。该体外类器官模型有助于针对GJB2相关听力损失的内耳细胞疗法和药物筛选。内耳类器官提供了一种便利的体外疾病模型，并为内耳领域中相关机制的探究提供了实践基础。
iPSCs衍生的内耳类器官模型也已被用在检测基因矫正效果、研究病理的分子机制等方面。MYO7A和MYO15A突变是已知的人类耳聋基因。Jia-Rong Chen等［99］通过获取携带MYO7A和MYO15A突变患者的成纤维细胞，在体外培养出了异常的立体纤毛，并验证用CRISPR-Cas9技术矫正基因后，衍生的毛细胞恢复立体纤毛样突起结构。Makoto Hosoya等［100］的研究提取了双等位基因SLA36A4位点突变的Pendred综合征患者的iPSCs建立模型，揭示了Pendred蛋白功能障碍使听力损失的分子机制。
3.耳聋基因编辑与精准治疗
约有1/2的遗传性耳聋是由于内耳耳蜗中的毛细胞或支持细胞的基因突变造成的，目前已确定约140个等位基因与耳聋相关。目前临床上对于遗传性耳聋的治疗局限于佩戴助听器和人工耳蜗移植，这些设备通过放大声音或者直接电刺激听觉神经来帮助耳聋患者应对听力损失，但不能促进听力敏感度的完全恢复。通过基因递送或编辑治疗修复受损毛细胞或支持细胞是挽救受损听力的可行性方法。关于内耳生物学的研究主要来自体内胚胎和成年动物模型的研究，但对人类遗传程序的精确调控与操纵，以及在原生环境中对人类特异性疾病的探究可以通过体外细胞的培养直白地再现。内耳类器官可以用于测试基于细胞的治疗和基因治疗等新型耳聋疗法。
基因编辑是一种在DNA水平上对目的序列进行定点改造从而改变细胞命运及生物体特征的一门新兴技术，能够实现DNA碱基对的替换、插入与删除等多类型改造。基因编辑技术作为一种新兴工具已运用于多种遗传疾病的治疗，对遗传性耳聋也是一种潜在治疗策略。基因编辑技术的出现让基因治疗成为可能，传统的基因编辑技术包括锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）及成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR-Cas9）可以实现疾病基因的敲除及目的基因的敲入。其中CRISPR-Cas9更加简单高效，在向导RNA（guide RNA，g RNA）的引导下即可在任意细胞中进行定向靶点的基因编辑。在人类致病基因变异中，58%是由致病点突变引起的，传统的基因编辑技术通过DNA双链断裂进行编辑容易产生碱基的插入与缺失，不适于精准的单碱基编辑。碱基编辑器（base editing，BE）这一新兴工具的出现很好地填补了精准点突变纠正治疗的研究。目前已有多篇文献先后报道了基因编辑技术在耳聋小鼠模型中的治疗研究应用。
相较于转基因小鼠，内耳类器官更易进行遗传操作，是研究基因治疗的新兴模型。类器官中的基因诱导表达主要通过3种方式：脂质体递送、慢病毒感染、Tet On诱导体系等。以在内耳类器官中过表达Lin28b基因为例，将1 ug表达质粒与4 u L脂质体Lipo2000共同加入含有耳蜗器官的培养基中600 g共离心30 min，递送效率约为5%；另一种方式是将转染质粒与Lipo2000加入类器官培养基中共孵育24 h，第二天更换新鲜的培养基，基本无效率。慢病毒感染方式是将生产病毒的细胞培养物上清加入耳蜗类器官中，可以实现20%的表达效率。同样地，也可以以慢病毒感染形式通过CRISPR-Cas9将类器官中的特定基因敲除，实现和小鼠病毒感染相似的编辑效率［93］。Tet On诱导方式主要是通过四环素在内耳类器官中实现有效基因的有效表达［75］。此外，王秋菊实验室报道CRISPR-Cas9基因编辑技术可成功纠正TMC1 p.M418K突变的耳聋患者来源的iPSCs细胞系。虽然这些细胞还未分化成内耳类器官，但它们显示出了良好的分化潜力，可以用于评估人类细胞对CRISPR校正的反应［101］。内耳类器官的出现一定程度上很好地代替了小鼠模型的费时费力研究，更加方便可控，同时其来源于人类干细胞，更符合人类基因组的表达状态。对其进行基因编辑可以很好地模拟人类耳聋疾病的治疗，促进了耳聋疾病基因治疗的研究。(https://www.daowen.com)
4.毛细胞再生疗法
（1）功能性毛细胞再生研究
一些较早围绕耳蜗干细胞或祖细胞再生展开的研究是在体外通过2D培养进行的。内耳的发育一般认为来源于外胚层的耳板，在小鼠中发育起始于E8.5天时后脑附近的双边增厚的外胚层。E10.5天时，耳板会开始内陷形成封闭状的听泡。当听泡闭合后，听泡腹侧区域耳蜗前庭神经节开始出现分层，同时听泡背侧中线狭长区域开始向大脑延伸内淋巴管。蜗管也是以逐渐包合的方式形成于听泡腹侧区域并持续增长至E18天［102］。在蜗管长到E13.5～14.5天时，Corti器K域部分细胞开始表达细胞周期抑制子及并停止增殖，继而感觉原基的毛细胞及支持细胞开始分化。当耳蜗中圈及底圈毛细胞前体细胞发育至有丝分裂终末时即开始表达［103］。小鼠ESCs［104，105］和iPSCs［106］已经成功被诱导分化为内耳前体细胞样祖细胞。部分ESCs或iPSCs来源的内耳前体细胞可分化为具有纤毛结构的毛细胞。当这些毛细胞受到机械刺激时，它们也能发出与未成熟毛细胞相似的信号，这表明这些被诱导的毛细胞至少具有一定程度的毛细胞功能。类似的方法也被用于耳的感觉神经元的再生［104，107］。尽管这些研究获得了不同成熟度的分化细胞，但终末分化细胞的分化效率和成熟度依然十分有限。通常在培养过程中，需要添加生长因子或小分子来调节耳蜗干细胞或祖细胞的增殖分化和命运决定。但是最近，基于转录因子过表达的基因直接重新编辑已被证实能够促进听觉神经元的分化［108，109］和感觉毛细胞的体外再生［110］。
随着3D类器官培养技术的发展，包括视杯、小肠、脑等多种组织器官的类器官已经被成功开发出来［3，111］。与此同时，耳类器官相关的研究也逐渐得到了重视，而耳类器官根据干细胞来源和再生毛细胞的特征又分为耳蜗类器官和前庭类器官。Karl R.Koehler等人成功地通过小鼠ESCs获得了包含功能性感觉毛细胞的“耳泡样”结构［112］。使用基质胶作为3D培养基质，首先用无血清培养基进行外胚层的初始诱导，然后通过BMP生长因子刺激诱导向表皮外胚层分化。随后，通过下调BMP信号和上调FGF信号，诱导细胞团分化为胚胎基板［113，114］。该团队后续研究通过GSK3β的抑制剂CHIR99021增强Wnt信号促进了向耳类器官的分化［115，116］。使用同样的方法，h ESCs和hiPSCs来源的耳类器官也被成功地开发和发展出来［117，118］。但是在小鼠ESCs来源的耳类器官模型中，毛细胞最早在体外培养2～3周时出现，而人类细胞分化为感觉毛细胞的时间则延长到第10周（70天）。通过这些方法培养的耳类器官呈囊泡状结构，分化的毛细胞呈斑块状分布，周围环绕着支持细胞，类似于前庭平衡觉器官。Karl R.Koehler等［117］通过胚胎干细胞再生的耳类器官毛细胞，其电生理特性、纤毛束的形态和突触连接等特征更接近前庭毛细胞，而不是耳蜗毛细胞。前庭器官的机械感觉毛细胞出现在人类发育的第10周，在第12周形成纤毛束，而直到第12～14周才开始分化耳蜗毛细胞［119，120］。此外，一些研究可能表明目前耳类器官的培养过程缺少向耳蜗命运分化的生长因子。例如，SHH信号被认为可以诱导耳泡腹侧的同一性［121］，但是目前的分化条件不包含SH H信号刺激。Michael Perny等培养的ESCs还能产生双极神经元［122］，它们能够与新生毛细胞形成突触连接。通过对不同时间点的基因表达进行分析，证实耳类器官的发育经历了耳发育和成神经细胞特化的阶段，最终产生感觉神经元。但是由于ESCs或iPSCs来源的内耳前体细胞和毛细胞与听觉上皮的细胞具有较大的异质性，极大限制了ESCs或iPSCs来源内耳细胞在研究上的应用。
Will J.Mclean等［95］根据肠类器官建立的方法在体外培养Lgr5阳性耳蜗支持细胞，成功获得了支持细胞来源的耳蜗类器官，研究表明使用基质胶培养耳蜗Lgr5阳性干细胞能够形成囊状类器官，而非球型实体类器官。除了使用EGF和FGF等生长因子刺激［40］和使用CHIR99021增强Wnt信号通路［123］，组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA［124］也通过调节染色质重塑来促进干细胞的增殖。尽管起始细胞只包含少量的Lgr5阳性细胞，但是这些成长因子会促进Lgr5阳性支持细胞的快速增殖。然后，使用LY411575来抑制Notch信号通路，联合使用CHIR99021激活Wnt信号，促进Lgr5阳性支持细胞向毛细胞分化。这种方法获得的再生毛细胞的顶端具有静纤毛，能够表达内毛细胞的标志蛋白VGLUT3，或者外毛细胞标志蛋白PRESTIN。更重要的是，通过该方法，体外毛细胞分化的效率和再生毛细胞的成熟度都明显优于2D培养条件下的耳细胞团［125］。
与小鼠不同，人类组织特异性耳蜗祖细胞只能从人类胚胎耳蜗中获取，Marta Roccio等发现这些耳蜗祖细胞也表达p27、Sox2、Lgr5和p75［120］。在基质胶中进行培养，在生长因子的刺激下，这些有丝分裂静止的祖细胞，能够重新进入有丝分裂周期，能够增殖分化并表现出感觉上皮的组织性和极性。这些类器官在体外培养数周后能够形成感觉毛细胞和支持细胞，再生的毛细胞产生了ESPIN和F-actin阳性的纤毛束。耳毒性药物——氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素能够对再生毛细胞产生毒性，表明人胚胎耳蜗类器官可用于体外耳毒性药物的筛选。胚胎耳蜗类器官的研究依赖于胚胎发育10～11周的样本，但是这些组织特异性祖细胞的增殖和分化能力也受到了明显的限制，形态结构等特征与真实的器官仍有很大差距。
以上所述的内耳类器官正在成为再生医学细胞治疗中获取功能细胞类型的来源。鸟类和两栖动物可以自然地再生失去的毛细胞，因为感觉器官内的支持细胞可以转化为毛细胞或分裂产生更多的毛细胞或支持细胞的祖细胞。有限的毛细胞自发再生在哺乳动物的前庭器官中存在，但新生的前庭毛细胞不具有成熟的生理功能。在动物或类器官培养中进行的发育与再生研究，能够为解决这些局限性提供新的见解。在体外通过给予一定生长条件，如培养基、各种生长因子（N2、B27、FGF、EGF等）和基质胶等形成的3D培养环境，先实现干细胞的增殖，进而通过一些小分子，如Wnt激活剂和Notch抑制剂等调节干细胞的分化，使其分化为毛细胞，最后进一步通过添加一些能够促进毛细胞成熟的因子促进再生毛细胞的成熟，从而形成相对成熟的内耳类器官。类器官操作便捷，能够为筛选调控功能性毛细胞再生的关键转录因子、小分子化合物，甚至是新型生物材料提供平台。近期，Zhong Zhang等［61］利用Ti3C2Tx MXene调节基质胶水凝胶的理化特征，使其表现优异的生物相容性；进一步发现MXene-基质胶复合水凝胶能够调节耳蜗类器官的生长，尤其是促进耳蜗类器官毛细胞电生理功能的成熟，一些特征不亚于体内原位毛细胞。然而，由于成熟内耳的结构复杂且难以接近，通过移植细胞来恢复听觉或前庭功能是非常困难的。目前仅在获得人类内耳上皮细胞方面取得了一些进展。继续深入了解胚胎内耳的精确时空信号模式，对于改善类器官培养至关重要。
（2）内耳器官修复与功能重建
体外扩增的类器官移植到动物中以修复受损器官具有可行性。然而，耳蜗类器官在动物模型体内器官修复还停留在体外研究阶段，没有体内器官修复与功能重建的成功案例。其他类型的类器官已经在动物模型中被报道。Giuliana Rossi等［126］利用小鼠ESCs或小鼠iPSCs构建的视上皮类器官移植到视网膜变性的小鼠模型中，成功产生成熟的光感受器，并与宿主细胞建立了突触连接，恢复对光的反应。Hiroshi Shirai等［127］证明视网膜变性的大鼠和灵长类动物移植的视上皮类器官（衍生自h ESCs）所产生的视网膜组织也能存活、成熟并表现出与宿主组织的一定程度的整合。Shiro Yui等［128］将小鼠结肠上皮细胞或干细胞源的肠类器官移植到小鼠体内均能不同程度地修复结肠黏膜损伤。同样，Robert P.Fordham等［129］证明由胎儿肠祖细胞生长而来的移植肠球在体内可与受伤的小鼠结肠结合并分化。此外，类器官也能够提供保护移植物免受不良病理环境影响的生态位。Juthaporn Assawachananont等［130］的实验表明类器官移植物能够比分离的胚胎视网膜祖细胞更好地融入宿主小鼠视网膜。
再生医学中使用的类器官还可以与体外遗传校正策略结合使用，以实现受遗传疾病影响的组织自体替换。Gerald Schwank等［131］在一项研究中使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑来纠正患者来源的iPSCs中导致囊性纤维化（cystic fifibrosis，CF）的最常见囊性纤维化跨膜导体受体（cystic fibrosis transmembrane conductor receptor，CFTR）突变，即508位苯丙氨酸缺失，然后成功用于生成功能性类器官。虽然只获得了初步的体外结果，但这些结果表明临床移植类器官来源的细胞和组织可能是可行的，也为耳蜗类器官的体内应用提供了参考。
内耳类器官移植的障碍主要来自内耳复杂的组织结构，包括盘绕的耳蜗、位置独立的半规管，以及对其功能至关重要的加速反应性耳石器官。在培养皿中培育出完整的内耳，甚至是用于移植的器官，目前还远不可行。然而，阐明参与形态学获取的基因程序，并在体外模拟这些过程，对于在培养皿中大规模获得感觉上皮至关重要。Mamoru Ishii等［132］已经证明逆行细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路是耳蜗管伸长和卷绕所必需的，并且可能是激活以获得结构更相似的组织的关键组成部分。Sarah Emily Hocevar等［60］也表明提供细胞外成分基质对耳类器官的正常形成至关重要。目前对这些内部和外部线索所起作用的理解仍然是初步的。
（薛天，柴人杰，章梅，张莎莎，齐洁玉，李夏琳）