11.2.2 内耳类器官的构建
内耳类器官可以诱导自多能干细胞或单能干细胞，包括内耳干细胞、胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、可诱导干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等（图11-5）。由ESCs和iPSCs形成内耳类器官的过程中，需要多种细胞因子或小分子药物配合使用才能完美地重现出在器官发育期间的各种表征，成体干细胞由于是单能干细胞可直接诱导分化。
图11-4 内耳解剖关系示意图
（a）耳蜗矢状面；（b）耳蜗蜗管组成；（c）耳蜗毛细胞、基底膜和盖膜的位置关系［26］
图11-5 内耳类器官的来源
1.内耳类器官的细胞来源
（1）多功能干细胞
图11-6 内耳类器官的构建［73，74］
（a）内耳的形成过程：在囊胚的原肠胚形成过程中，出现神经外胚层和非神经外胚层。TFG-β表达降低，BMP和FGF信号增加，刺激非神经外胚层形成。在非神经外胚层内，FGF和WNT信号升高，BMP表达减少诱导耳-鳃外胚层形成。持续的WNT刺激以及FGF信号减弱诱导耳基板发生。耳基板内陷形成听泡，在FGF、视黄酸（RA）、WNT和SHH信号的进一步作用下，最终形成内耳；（b）多功能干细胞以类似的方式进行分化：TFG-β抑制，FGF和BMP信号激活，在hPSCs聚集物表面产生非神经外胚层。通过BMP抑制和FGF激活，非神经外胚层形成耳-鳃外胚层。WNT信号的后续刺激引起诱导产生耳基板。耳基板内陷形成听泡，随后发育为内耳类器官。其他类型组织，包括软骨和皮肤，也在hPSCs聚集物中伴随形成；（c）以Lgr5阳性支持为例示意内耳干细胞形成类器官的过程。从出生后早期小鼠耳蜗中分离Lgr5阳性耳蜗支持细胞，制备单细胞悬浮液并嵌入基质胶。Lgr5阳性细胞的扩增阶段由Wnt激活诱导；引入Notch抑制诱导毛细胞分化
内耳起源于外胚层。在人类中，从受精12天开始，形成外胚层上皮。上皮分裂成非神经外胚层（也称为表面外胚层，non-neural ectoderm，NNE）和神经外胚层。非神经外胚层最终产生内耳以及皮肤的表皮。人类受孕后约52天产生第一个终末分化的毛细胞［图11-6（a）］。内耳的发生部位来自耳基板，位于颅内非神经外胚层和神经外胚层之间的交界区，即耳-鳃外胚层区（otic-epibranchial placode domain，OEPD）［28，29］。内耳的上皮层、神经元细胞和胶质细胞来自外胚层细胞，而围绕内耳间充质细胞来自中胚层的胚层和颅神经嵴［30］。人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，h ESCs）向特定组织的分化需要模拟胚胎发育过程中复杂的通路和转录因子组成的调控网络。内耳类器官的命运决定需要成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、WNT信号、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、声波刺猬（sonic hedgehog，SHH）信号转导、维A酸等信号因子的精密调控［图11-6（b）］。Jie Ding等［31］使用h ESCs诱导分化出的耳上皮祖细胞（cochlear epithelial progenitor cells，OEPs），在添加EGF和维A酸的鸡椭圆囊基质细胞条件培养基中进行分化，形成了类似于毛细胞样细胞的上皮细胞簇，细胞表面具有肌动蛋白组成的纤毛束。h ESCs体外培养能够为信号通路的研究提供帮助。Fengjiao Chen等［32］使用h ESCs细胞系X1，分离细胞团并添加N2、B27、FGF3和FGF10培养12天，成功获得分化的内耳祖细胞；通过定量逆转录-聚合酶链式反应检测了调控毛细胞分化的关键信号Notch配体和受体的时间表达模式，推测JAG2和DLL1在毛细胞体外分化过程中可能具有协同作用。Karl R Koehler等人［33］先将人胚胎干细胞（WA25细胞系）在E8培养基中孵育2天，再转移到含有低浓度基质胶和FGF的分化培养基中，诱导外胚层的分化，形成致密的球形细胞团，其中每个细胞有大核仁的特征。之后，抑制TGF信号通路并用BMP-4刺激外胚层分化，到第4天分化出非神经外胚层（又称表面外胚层）和神经外胚层。与此同时，耳基板向内凹陷形成耳囊泡，不对称的基因表达导致背腹和前后的分化。随后，用LDN-193189抑制BMP信号通量并添加FGF-2诱导细胞聚集体向OEPD分化，第8天OEPD形成，而后用糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）抑制剂CHIR99021处理，发现第12天聚集体表面出现了上皮突起，预示着体内囊泡发育前耳凹的形成。Louise Menendez等［34］还使用4种转录因子（Six1、Atoh1、Pou4f3和Gfi1）组合将小鼠胚胎成纤维细胞、成年大鼠成纤维细胞和出生后耳蜗支持细胞转化诱导为毛细胞样的细胞，且转化效率高于单独使用毛细胞分化的决定因子Atoh1。
Kazutoshi Takahashi等［35］将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种转录因子引入小鼠成纤维细胞，发现成纤维细胞逐渐发生转化，并产生了与ESCs具有相似特征的细胞，包括形态、基因、蛋白表达、细胞增殖能力、分化能力等。从iPSCs到内耳类器官的过程，也需要多种信号通路的作用。截至目前，几乎所有iPSCs诱导内耳类器官发生的研究都是在Karl R Koehler等［36，37］建立的逐步诱导方法的基础上进行改进，诱导的毛细胞大多表现为Ⅱ型前庭毛细胞的特征，诱导的步骤主要包括：①形成表皮外胚层和耳基板；②形成内耳祖细胞；③形成带有感觉上皮的腔内精细结构［38］。与ESCs相比，iPSCs具有相似的分化多能性和自我更新能力，而在来源方面，iPSCs可以通过体细胞的体外诱导产生，避免了以往对胚胎的动用，从而减少医学伦理的争议［37］。同时，iPSCs容易获取，可以大量克隆，为体外干细胞研究和细胞治疗提供了丰富的细胞来源。当然iPSCs的使用也存在一定问题。自发分化和染色体畸变积累的结合可能会对iPSCs在传代时造成限制，培养物通常不能维持超过14天［37］。
（2）内耳干细胞
体外神经球培养方法的建立，促进了体外耳细胞团培养技术的发展［39，40］，这有助于分离残留在内耳感觉组织中的假定的干细胞或祖细胞。尽管内耳细胞团克隆形成能力、自我更新能力和多能性的来源一直没有被研究，但是事实上，研究人员已经发现耳蜗感觉上皮中存在可以在体外分化为支持细胞或毛细胞的祖细胞，而从螺旋神经节（spiral ganglion，SGN）分离出来的细胞群可以分化为感觉神经元（sensory neuron）。Huawei Li等［41］通过解离并培养内耳单细胞研究了小鼠内耳不同区域细胞的再生潜能，发现小鼠的前庭感觉上皮细胞在出生4个月后仍能增殖形成细胞球体。谱系追踪和细胞分选实验表明神经节内的胶质细胞可以作为神经元祖细胞［42］，而内耳感觉上皮中的支持细胞表现出毛细胞祖细胞的特征［43］。
目前已知多种具有再生潜能的内耳干细胞类型。根据Sox2、p27、p75和Lgr5等的表达进行细胞分选后分离出耳蜗支持细胞（cochlear support cells），结果表明支持细胞的几种细胞亚型具有增殖能力［44，45］。Wnt信号通路的基因，多种已被公认为具有增殖和分化能力的成体组织的干细胞标记物［46］。Wnt信号通路在耳蜗的发育形成中起着关键作用，其中Lgr5被认为是小鼠耳蜗祖细胞最严格的干细胞标志基因之一［44，47］。耳蜗支持细胞的第三排Deiters细胞、内柱细胞、内指细胞和内缘细胞表达Wnt的靶基因Lgr5［48，49］。胚龄18.5天时，小鼠内耳毛细胞和支持细胞均表达Lgr5，之后逐渐下调［48］；在出生后一个月的成年小鼠耳蜗中，只有三行Deiters细胞保持Lgr5阳性。近年来在鸡、啮齿动物和其他物种上的研究已经阐明，内耳毛细胞内源性再生有两种机制：支持细胞直接转分化为毛细胞，以及支持细胞进行有丝分裂产生子细胞，随后分化为毛细胞［50，51］。新生小鼠耳蜗中的Lgr5阳性细胞能够在损伤后出现细胞增殖并分化出毛细胞［52］。此外，也能通过增强WNT信号或抑制Notch信号来增强Lgr5阳性细胞的再生能力［44，47，52］。然而，这些再生特性并不是Lgr5阳性细胞所独有的，在耳蜗损伤后也观察到了Lgr5阴性支持细胞的增殖。同样，在椭圆囊中，损伤也被证明能够增强Lgr5的表达和毛细胞的再生［53］。因此，耳蜗和椭圆囊中的Lgr5阳性支持细胞被认为是内耳干细胞或祖细胞。其他蛋白标记的细胞大都在Lgr5阳性支持细胞范围内。Axin2是Wnt信号通路下游的负反馈基因，它在发育中的耳蜗管及其周围于Lgr5有不同的表达［48］。Taha Adnan J.Jan等［54］发现Axin2阳性边界细胞具有耳蜗祖细胞的特征，可以增殖成细胞集落，并分化为支持细胞和毛细胞。此外，Axin2阳性细胞的增殖和分化可以被Wnt激动剂诱导，并被Wnt抑制剂抑制，类似于Lgr5阳性干细胞。Frizzled9是Wnt通路的受体基因之一，其在新生耳蜗的内指细胞、内缘细胞和第三排Deiters细胞中均有表达，且与Lgr5阳性干细胞的亚群有差异。Frizzled9阳性支持细胞在体内和体外均能再生为毛细胞，且具有与Lgr5阳性祖细胞相似的增殖和分化能力［55］。Lgr6阳性细胞是Lgr5阳性干细胞的一个亚群，仅包括新生小鼠内耳的内柱细胞。Lgr6阳性细胞与Lgr5阳性干细胞相似［56］，在体外可产生毛细胞，且相同数量的Lgr6阳性细胞可产生更多的毛细胞；但Lgr5阳性干细胞形成的细胞球比Lgr6阳性细胞多，表明Lgr6阳性细胞较Lgr5阳性干细胞的分化能力较强而增殖能力较弱［57］。因此，靶向Lgr6阳性细胞来再生毛细胞可能有更高的效率，有助于补充损伤的毛细胞。
2.内耳类器官的构建方法
（1）培养体系
鉴于器官的正常发育需要协调细胞群精准增殖与分化，传统2D培养中细胞黏附在培养板或悬浮培养，其缺陷在于不具备组织结构的复杂性，无法模拟体内微环境。为了使体外培养的细胞聚集物更具备组织性，3D培养技术应运而生。对具备全能性的干细胞在3D培养基质中施加特定生长因子以及小分子进而诱导发育为自组织有机型结构即类器官（organoid）。细胞在3D基质中自我组织，更具像化的模拟体内发育过程中的自我组织过程，其功能类似于正在复制的器官，这种培养方案已被广泛应用于功能组织诱导、疾病模型建立以及药物筛选等多个方面的研究，在基础研究和转化应用中具有很大的应用前景［58］。
为了更优化培养条件下的细胞-细胞间以及细胞-细胞外基质（extracellular matrix，ECM）连接作用，诱导细胞发展进程，目前已开发了多种用于干细胞3D细胞培养的支架系统，主要分为两种：通过外力介导的无支架的系统（如悬挂滴法、旋转法和磁力法）和基于3D支架的系统（如水凝胶基质、微流控芯片等）。无支架系统的缺陷性在于无法重现细胞间的黏附和迁移，更无法实现自组织系统的研究。而3D支架系统可以通过调节生物组分以及合成材料来调节其孔隙程度、表面化学性质和刚度，更准确地模拟特定的细胞组织增殖与分化以及后续自组织的微环境，以达到最佳的类器官形成条件［59］。基质胶作为目前常用的类器官3D培养支架系统，该基质主要成分是ECM蛋白（即～60%的层黏蛋白（laminin）、～30%的胶原蛋白Ⅳ（collagenⅣ）和～8%的内黏蛋白（endomucin）以及几种生长因子，包括胰岛素生长因子Ⅰ（insulin like growth factorⅠ，IGF-1）、TGFβ和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。在基质胶培养条件下，可以将分离的内耳干细胞有效分化为内耳类器官［60［］图11-6（c）］。(https://www.daowen.com)
虽然基质胶作为目前类器官培养中最受欢迎的基质凝胶，但据报道，由于其商业特性，不同批次之间的生化特性存在差异，生长因子浓度无法保证一致性，导致细胞培养实验缺乏可重复性。此外，由于其不易被定制，因此无法完全匹配不同组织类器官的培养。基质凝胶的这些不良特性推动了对其他化学和机械定义明确的天然和合成类器官培养支架的研究。Zhong Zhang等［61］将Ti3 C2 Tx MXene纳米材料纳入基质胶，调节了基质胶的性能，促进了耳蜗类器官的发育，有利于类器官毛细胞的形成以及促进共培养系统中的突触形成效率，进一步开展了纳米材料在类器官发育和听力损失治疗研究中的应用。在内耳类器官的研究中，除了基质胶，其他生物合成支架并未有报道，所以更好地研究其他细胞外支架（天然和合成），促进内耳干细胞重组为功能组织，是开发和改进类器官再生医学方法的关键。比如，通过聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）水凝胶为主体用以培养肠道干细胞（intestinal stem cells，ISCs）和肠道类器官的3D培养系统，通过在该系统中添加促进ISCs增殖的RGD（Arg-Gly-Asp）肽段以及有机体形成所需的层粘连蛋白，创造出一个稳定的肠道类器官培养系统，并通过调节该系统的物理化学参数达到ISCs最佳扩张条件［62］。此外，明胶甲基丙烯酸酯（gelatin methacrylate，Gel MA）水凝胶也因其合适的生物特性和可调理的物理特性而适用于类器官的培养研究，并且混合水凝胶系统也可以通过将Gel MA与纳米颗粒以及其他聚合物混合来形成具有特定组织所需要的对应组合性能的基质网络［63］。
（2）培养基的确定与选择
内耳类器官可以从各种干细胞的培养中进行诱导。ESCs、iPSCs以及小鼠的内耳干细胞均可以在特定的ECM（通常是基质胶）、特定的介质及细胞因子的作用下形成内耳类器官，包括HEPES、Wnt信号激活剂和其他生长因子，如EGF、FGF、BMP、B27、小分子抑制剂以及相关的允许类器官生长的激素［64］。EGF、IGF-1和β-FGF因其有丝分裂功能、促进生存活性或诱导某些细胞表型的能力，被认为在内耳发育过程中发挥作用。ESCs由于其全能性高，可以通过引入参与正常发育的信号和转录因子来指导特定细胞类型的产生。ESCs的分化可以在体外诱导发展为聚集胚状体。胚状体来源的细胞在无血清培养基中与N2补充剂、EGF和IGF-1存在条件下富集内耳祖细胞，并利用β-FGF进一步扩增；随后去除这些生长因子启动分化，观察到终末分化的毛细胞标志物肌球蛋白VIIA（MYOSIN7A）、ESPIN、PARVALBUMIN等的强烈表达，并伴随着MATH1与MYOSIN VIIA/BRN3.1的共表达。然而，通过该方法诱导生成的毛细胞样细胞并不具有典型的毛细胞形态［65］。在随后的研究中，通过对BMP、TGF-β和FGF信号的精确时间控制，ESCs聚集胚状体依次分化衍生的毛细胞表现出天然机械敏感毛细胞的功能特性，并与来源于ESCs培养物的感觉神经元形成突触连接［36，66］。通过对耳蜗感觉上皮分离的Lgr5阳性干细胞进行体外扩增与分化，将CHIR99021和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸（valproic acid，VPA）［67］添加到包含生长因子EGF、β-FGF和IGF-1的培养体系［68］中进行增殖，后续加入γ分泌酶抑制剂LY411575［69］诱导可以高效诱导内耳类器官的形成［70］。也可以直接从新生小鼠中分离出耳蜗上皮细胞，通过在基质胶培养条件下添加有丝分裂原等生长因子进行3D培养，可以在体外使小鼠耳蜗上皮细胞重新进入细胞周期并产生毛细胞，分化为类器官［71］。
位于基底膜上的柯蒂氏器（organ of Corti）是内耳中关键的听觉感受装置，由内、外毛细胞，支持细胞，网状膜（reticular membrane）与盖膜（cap film）等构成。内耳感觉上皮中含有机械敏感性毛细胞，能通过神经元的神经支配将信息传递到大脑。螺旋神经节神经元是连接初级听觉感受器细胞、毛细胞和听觉脑干的双极神经元（bipolar neuron）。在内耳发育过程中，来自相邻听觉螺旋神经节的信号诱导了感觉毛细胞前体的终末有丝分裂（mitosis）及其随后的分化［72］。螺旋神经节在耳蜗室微环境塑造中起着重要的作用。内耳类器官结合神经搭建的共培养模型构建，可以更好地实现耳蜗室微环境的成熟和功能化。此外，功能性突触（functional synapse）的建立对听觉信号的感知至关重要。在这种共培养系统中产生具有功能突触连接的耳蜗将有助于理解毛细胞突触机制的形态、生理和分子特征。
3.内耳类器官的鉴定
（1）明场形态特征
利用3D类器官培养方法，多功能干细胞通过一系列定向分化步骤形成：①表面外胚层和耳膜平台组织；②耳膜囊泡内的内耳祖细胞；③内衬感觉上皮管状结构，以此体外诱导内耳感觉上皮细胞的形成，包括毛细胞、支持细胞和支配的感觉神经元。培养开始时，将胚胎或多功能干细胞聚集在低细胞黏附的96孔培养皿中。细胞聚集物在增殖约第3天开始形成管腔，在增殖阶段直径增加［75］；从第6～8天开始，聚集物通常显示外层上皮增厚，形成NNE、OEPD和耳基板（otic placode）。从第8～11天开始，每个聚集体的表面变得“光滑”，因为聚集物内部的细胞迁移到表面。囊泡在第12天可被明显分辨。到第20～24天，～10%～20%的聚集体应该产生直径为200～1 500μm的囊泡。通常情况下，这些囊泡可能嵌在聚集物中，也可能冲破表面上皮，从聚集物中凸出。感觉毛细胞在囊泡中发育，含有毛细胞的囊泡称为内耳类器官［76］。
源自小鼠耳蜗感觉上皮干细胞的细胞球体群是异质的，由形态不同的类型组成，分为实心、过渡和空心3种形态。耳蜗感觉上皮来源的干细胞/祖细胞最初产生小的实心球体，随后过渡到空心球体，这种变化伴随着大多数球体细胞的上皮分化。只有固体球体，以及在较小程度上的过渡球体，可能含有自我更新的干细胞，而空心球体不能一直增殖［77］。
（2）细胞标志物
通过3D基质胶培养的来自多功能干细胞的耳囊样结构可能包括存在于耳蜗和前庭中的所有细胞类型［78］。内耳类器官形成的早期阶段，细胞聚集物表达PAX2（耳部基板形成的关键因子）和ATOH1（内耳毛细胞分化的关键因子）。ATOH1的表达对于内耳发育的所有阶段都至关重要，因此是跟踪毛细胞诱导和成熟的主要标志物。类器官的内部区域中也发现了表达PAX6（神经祖细胞标记物）的细胞。类器官中也含有SOX2阳性表达的细胞。SOX2是环绕耳蜗毛细胞和前庭毛细胞的支持细胞的标记物。通过免疫荧光染色，可以检测在类器官发育中不同时间段的内耳类器官中毛细胞标志物的表达。在分化的第6天，细胞聚集物上皮细胞开始表达PAX8，这是OEPD发育和形成的标志物；在第8～12天，OEPD产生含有PAX2、PAX8细胞；第12～14天，囊泡表达前感觉标志物SOX2和JAG1；囊泡也以弥漫模式表达MYO7A，类似于体内发育中的耳泡；在第14～16天，囊泡表达MYO7A、BRN3C、SOX2、PAX2和CALRETININ表达；第20～28天，MYO7A、CALBINDIN2和BRN3C表达，阳性细胞分别表现出Ⅰ型和Ⅱ型前庭毛细胞的圆柱形或烧瓶状形态特征［76］。此外，在分化的毛细胞顶端表面观察到ESPIN阳性静纤毛束［79］。类器官中发现的神经元-上皮区域与内耳发育一致。因此，类器官在分化的不同时间点出现内耳祖细胞、毛细胞以及神经元标志物的表达，这表明生长中的类器官可能涵盖了内耳发育的各个阶段的细胞。在类器官生长早期阶段，大多数小囊泡中的细胞表达典型的蛋白，如PAX2、PAX8、ECAD、EPCAM、SOX2+和JAG1以及FBXO2，表明前板状外胚层的形成。在成熟培养基中分化后，ATOH1+毛细胞出现在囊泡的腔内。这些新生毛细胞最初出现在小鼠内耳类器官的第14天左右，以及在人类内耳类器官的第40天左右。随着毛细胞的成熟，可以检测到典型的毛细胞标志物，如MYO7A、PCP4、POU4F3、ANXA4、ESPN和SOX2等。与体内的毛细胞一样，内耳类器官中的毛细胞被支持细胞包围，并在其基底外侧区域形成突触连接。此外，也检测到PRESTIN（外毛细胞上的运动蛋白）的表达。在不表达PRESTIN的细胞中发现内毛细胞标志物VGLUT3的表达。同时新生毛细胞迅速积累了染料FM1-43，其通过活性转导通道进入毛细胞［70］。
许多毛细胞特异性基因随时间的增加表达量也是逐渐增加的。作为毛细胞分化后发育所必需的基因，Pou4f3与细胞转导和突触特化有关［80］。Gfi1也作为内耳毛细胞分化所必需，其损失会导致程序性细胞死亡［81］。Gfi1有促进毛细胞发育的双重机制，包括抑制神经元相关基因以及激活正常成熟功能所需的毛细胞特异性基因［82］。听觉和前庭毛细胞中的感觉转导需要跨膜通道蛋白TMC1和TMC2［83］。TMC1被认为是听觉毛细胞中机械换能器通道的主要成分［84］。
内耳类器官中细胞簇的细分也可以根据各类毛细胞的标记基因进行统计，比如内毛细胞选择性表达CTBP2、OTOFERLIN以及VGLUT3。VGLUT3的主要功能是将这种神经递质转运到囊泡中。在没有VGLUT3表达的情况下，谷氨酸的摄取和释放在内毛细胞的传入突触处被破坏［85］。同时，FGF8也可作为内毛细胞的标记［86］。外毛细胞也有一些标记基因，比如Slc26a5、Chrna10、Chrna9、Strc、Kcnq4、Ocm、Insm1、Ikzf2以及Pieo2等。Slc26a5编码外毛细胞的运动马达蛋白PRESTIN［87］，属于包括10个成员的多样化转运蛋白家族。与该家族的其他成员不同，作为独有的膜蛋白，PRESTIN具有快速动力学的电压驱动电机作用，在哺乳动物的柯蒂氏器内提供周期放大声音的作用［88］。CHRNA9参与耳蜗毛细胞发育，在成人耳蜗的外毛细胞中表达。OCM是推定的OHC可能标志物［78］。有研究表明，PIEZO2在耳蜗的OHC和前庭毛细胞中表达。PIEZO2位于毛细胞体内的顶端，并且对于在毛细胞发育过程中观察到的反极性电流是必需的［89］。前庭毛细胞的标记基因比如Calbindin2，独特地标记小鼠的Ⅱ型前庭毛细胞，但有研究表明耳蜗类器官中未检测到CALBINDIN2表达［78］；也有发现认为FGF8是Ⅰ型前庭毛细胞身份的特异性和早期标志物［90］。
（3）细胞形态
扫描电镜是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。可以利用扫描电镜对源自干细胞的内耳类器官表面形貌进行表征。扫描电镜显示，实心细胞球由密集排列的细胞组成。过渡球的形状更不规则，表面比实心球更光滑。由于空心球的单细胞层组织脆弱，在扫描电镜样品处理过程中经常出现部分坍塌的现象，因此空心球体的壁是由单层扁平细胞形成的，且空心球体的管腔通常没有细胞［78］。
氦离子显微镜（helium ion microscope，HIM）是一种相对新颖的仪器，具有原子级大小的发射源，可以提供亚纳米级的氦离子束，在样品上扫描成像或刻蚀加工。目前广泛应用于生物成像、纳米光刻、铣削金属和2D材料、构筑超导隧穿结、制备纳米孔以及3D纳米光刻等方面。HIM分析显示，内耳类器官的表面由一层致密的纤毛样细胞层组成，类器官的表面形态与怀孕10周的人胎儿前庭器官的结构非常相似。
（4）转录组分析
DNA由外显子和内含子组成，外显子指导蛋白合成，内含子不编码蛋白，但会影响基因活性和蛋白表达。全基因组测序是对包括内含子及外显子在内的整个基因组序列进行测序而得到的完整的基因组信息。公开可用的scRNA-seq数据集有助于揭示细胞群的身份、组成和比例，产生特定细胞群的谱系，并提供体内比较以验证体外分化效率。Van der Valk等［73］详细综述了分化生长的类器官中代表的细胞类型，以及缺失的细胞类型。大多数scRNA-seq数据集的分析表明，在耳类器官中产生的毛细胞本质上是前庭毛细胞，但有一些推测性报告表明已经产生了假定的耳蜗细胞。
（5）功能鉴定
FM染料可以对类器官中再生的毛细胞进行鉴定。FM1-43等小苯乙烯染料通过开放的机械转导通道进入内耳，可在活体组织快速、特异性地标记毛细胞［91］。成熟毛细胞通过位于立体纤毛中的机械转导通道对苯乙烯基吡啶染料FM1-43表现出快速渗透性［78］。突触囊泡和分泌囊泡非常小，很难实时跟踪囊泡循环。包括FM1-43在内的FM染料可用于实时测量活体神经元以及多种细胞中的胞吐作用和内吞作用。FM染料是突触前功能的极好特异性标志物，用于揭示各种囊泡的性质和分布，可用于分别测量胞吐作用和内吞作用。
全细胞膜片钳可以比较新生成的毛细胞与天然毛细胞的功能相似性。静息膜电位、去极化产生动作电位（action potential，AP）、电压响应、电流响应、向外整流、平均快速分量的典型Ⅰ-Ⅴ曲线和低分量的K+电流，以及钙电流等电生理特性的检测指标可以用来评估类器官毛细胞的生理功能。