12.4.4 构建皮肤肿瘤研究模型
新型肿瘤靶向药物与肿瘤免疫疗法在基础研究与临床转化的过程中往往会受限于患者的不可操控性、实验动物和人类之间的巨大差异以及动物实验的长周期和高成本，这导致相关的肿瘤药物从基础到临床的转化效率极低。类器官技术的兴起为肿瘤研究提供了新的技术平台，尤其结合基因修饰技术，肿瘤类器官对揭示肿瘤发生发展的机制、快速评估肿瘤药物与免疫疗法的治疗效果方面意义重大。截至目前，大规模的肿瘤类器官库已经建立，类器官技术已经成为肿瘤研究中的重要工具。皮肤类器官几乎含有各种皮肤癌的前体细胞［2］，因此皮肤类器官模型有可能在皮肤肿瘤建模应用中有巨大潜力。常见的皮肤类器官肿瘤的诱导方式包括：将类器官暴露于外部压力下（如紫外线辐射或毒性因素）以诱导皮肤类器官形成肿瘤；将CRISPR-Cas9系统应用于皮肤类器官以建立特异性突变，如敲低肿瘤抑制因子或过表达皮肤相关癌症诱导因子的靶基因构建肿瘤模型［44］。目前已成功构建的皮肤类器官肿瘤模型包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、Merkel细胞癌等［45-47］。
1.黑色素瘤类器官
黑色素瘤是一种来源于黑色素细胞的高度恶性皮肤肿瘤，占皮肤癌死亡的75%，全世界每年约有132 000例新增病例，发病率逐年增加。类器官可以模拟各类黑色素瘤独特的分子表达水平和体内特征，帮助研究人类黑色素瘤的发生发展、异质性以及可塑性。黑色素瘤类器官的构建有多种方式，下面将做简要介绍。
黑色素瘤类器官的构建可通过逐级诱导人多能干细胞分化为神经嵴细胞或黑色素母细胞，然后以紫外线辐射或E-钙黏蛋白的方式控制黑色素细胞的生长速率和表型。含有成纤维细胞和角质形成细胞的生物材料会为肿瘤的建立提供相应的内环境。在该模型中增加血液、淋巴管和毛细血管可以重建更完整的肿瘤微环境，有利于研究各种药物对肿瘤与周围组织的治疗和靶向作用［48］。黑色素瘤类器官同样可源于人体黑色素瘤细胞，对黑色素瘤患者的新鲜肿瘤组织进行机械切碎和酶消化后，使用100μm和40μm的过滤器产生40～100μm大小的球形细胞团。将细胞团重悬于胶原蛋白溶液中，并将混合物注入3D微流体培养装置的中心凝胶区域，在特殊的DMEM培养基（10% FBS、4.5 mmol/L葡萄糖、100 mmol/L丙酮酸钠和1∶100 pen/strep）中持续培养，即可构建出含有自身免疫细胞等多细胞类型的黑色素瘤类器官。通过分离患者的淋巴细胞，以1∶1的比例将其与上述细胞团混合，可构建免疫增强型的人类黑色素瘤类器官［49］。已有研究通过流式细胞术、免疫荧光染色等技术对黑色素瘤类器官进行免疫分型并分析分泌的细胞因子，确认黑色素瘤类器官保留了自身免疫细胞，如肿瘤浸润性T淋巴细胞群。此外，基于细针吸取技术的简单微创类器官培养技术也可用于构建黑色素瘤类器官［50］。使用细针吸取采样技术直接分离患者或切除的少量肿瘤组织，无需消化处理步骤直接将样品重接种于基质胶中，并在含有胎牛血清（FBS）和B27补充剂的DMEM/Hams F12/MCDB105（2∶1∶1比例）混合培养基中培养，可以得到保留完整细胞群和组织生长模式的黑色素瘤类器官。这种方式构建的黑色素瘤类器官可以通过固体或半固体形式培养和传代，无需胰蛋白酶消化。随着细针吸取活检技术在临床实践中的广泛应用，该方式构建的肿瘤模型可广泛应用于临床和基础研究。
目前利用黑色素瘤类器官进行药物筛选和基础研究已成为较成熟的技术，多项研究报道了黑色素瘤类器官在筛选免疫治疗药物中的作用，如对纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗、达拉非尼、曲美替尼等药品的评估和筛选。也有研究使用黑色素瘤类器官研究肿瘤免疫机制：研究者将黑色素瘤类器官和患者自体淋巴细胞共培养，证明肿瘤细胞和T细胞的相互作用诱导了FKBP51的表达［51］。这些实验证明黑色素瘤类器官在药物筛选、药物疗效评价、患者个性化治和机理研究中发挥着重要作用。
2.鳞状细胞癌类器官
皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是最常见的皮肤恶性肿瘤之一，死亡率较高。皮肤鳞状细胞癌起源于表皮角质形成细胞，其发展由表皮角质形成细胞增殖和分化之间的不平衡驱动。组织病理学特征表现为异常增生的鳞状上皮细胞（角质形成细胞）突破基底膜浸润至真皮层甚至肌层［52］。皮肤类器官在鳞状细胞癌的机制研究也有极好的应用案例［45］。作为上皮组织稳态的关键参与者，跨膜酪氨酸激酶表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，也称为ErbB1和HER1）对鳞状细胞癌的发育至关重要。有研究利用3D全层皮肤模型评估了EGFR的过度激活和抑制对正常人体皮肤的影响。研究表明，将健康的体外人类皮肤模型持续暴露于高浓度的跨膜酪氨酸激酶表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）中会极大地改变表皮形态，促进角质形成细胞增殖分化。通过免疫组织化学分析发现，长期暴露于EGF的体外皮肤模型细胞增殖指数Ki67表达增加，早期分化模式紊乱，如仅在基底层有表达的早期分化标记物KRT10在EGF处理样本的整个表皮均出现表达。而酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼的使用则有效抑制皮肤表皮异常增生，证明了其对皮肤鳞状细胞癌患者可能存在较大的治疗潜力。(https://www.daowen.com)
3.Merkel细胞癌类器官
Merkel细胞是皮肤内参与触觉的特殊机械感受器细胞。Merkel细胞异常增生形成的Merkel细胞癌（Merkel cell carcinoma，MCC）是一种少见但致死率较高的恶性皮肤肿瘤，临床表现为在老年患者晒伤皮肤上的硬化性斑块和结节，以较高的局部复发率、淋巴结转移率为特点［53］。大部分Merkel细胞癌病理与Merkel细胞多瘤病毒（Merkel cell polyoma virus，MCV）感染相关。有趣的是，MCV虽然是诱导Merkel细胞癌的主要原因，但MCV实际上在人群中存在较为普遍，根据血清学试验的结果，约有60%～80%的人口感染MCV［54］。由于Merkel细胞癌是一种较为罕见的癌症，可用于研究的临床样本极少，也无相应的动物模型，因此其具体的发病机制仍不清楚。为了创造合适的研究模型，有研究利用MCV感染的MCC细胞系与皮肤类器官相结合建立了一种新的Merkel细胞癌体外研究模型，该模型构建的Merkel细胞癌与人类Merkel细胞癌病理学非常相似［47］。通过数种不同的整合方式，研究发现，在皮肤类器官中即使无上皮细胞成分和成纤维细胞成分，MCC样病变也可以在胶原机制中形成，但两者的存在会引起更为严重的MCC样病变。研究认为不同细胞类型之间的交互可能会促成MCC样病变的形成。
4.其他皮肤肿瘤类器官
（1）乳腺外佩吉特病类器官
乳腺外佩吉特病（extramammary Paget's disease，EMPD）是一种极为罕见的恶性皮肤腺癌，起源于顶泌腺导管开口的细胞或从表皮分化到顶泌腺的多能基质细胞［55］。由于缺乏与乳外佩吉特病相关的细胞系或有效的研究模型，近年来乳外佩吉特病的治疗几乎没有得到改善。类器官培养技术可以利用分离的乳外佩吉特病组织接种在基质胶中以生成乳腺外佩吉特病类器官［56］。苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色显示，患者原始组织的病理特征仍保留在类器官和类器官衍生的异种移植肿瘤组织中。该研究利用乳外佩吉特病类器官探讨了不同生长因子，包括神经调节蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和激活素对乳外佩吉特病类器官生长的影响，明确了HRG-HER3通路与乳外佩吉特病组织细胞的增殖有关。此外，使用类器官模型同样可评估化疗药物治疗乳外佩吉特病的疗效，有助于制定新的临床治疗策略。
（2）瘢痕疙瘩类器官
瘢痕疙瘩是皮肤结缔组织过度增殖引起的常见良性皮肤肿瘤，表现为继发于皮肤外伤或自发形成的异常增生的瘢痕组织，其特点包括病变超过原始皮肤损伤范围、持续性生长；外观表现为高出皮肤表面，充血，质地坚韧的结节状、条索状或片状肿块样组织，具有治疗抵抗和治疗后高复发率的肿瘤类疾病特征。瘢痕疙瘩是整形外科、烧创伤外科和皮肤科的常见病和多发病，也是一种临床治疗极其困难的难愈性疾病［57］。由于对瘢痕疙瘩发病机制的了解有限，难以制定瘢痕疙瘩的有效治疗方法。此外，瘢痕疙瘩是人体皮肤所特有的，不能在动物身上自发发展，导致缺乏瘢痕疙瘩的相关动物模型，基础研究难以进行。因此，开发新的动物或非动物模型对于探索瘢痕疙瘩病理机制和制定有针对性的临床治疗策略至关重要。类器官培养技术可利用源于患者瘢痕疙瘩活检组织构建瘢痕疙瘩类器官［58］。体外培养的瘢痕疙瘩类器官保持了患者瘢痕疙瘩的主要特征，且其组织结构、生物活性和组织学特征在培养期内稳定维持。构建和应用瘢痕疙瘩类器官的策略，为研究瘢痕疙瘩纤维化机制和探索合适的临床药物提供了重要途径。