HIV的临床检测
尽管二十多年前高效抗逆转录病毒疗法（HAART）已被用来治疗HIV阳性患者，但在发展中国家，艾滋病的流行率和病死率通常比发达国家更为明显。先进的诊断设备以及医疗基础设施的整体匮乏严重影响了HIV感染/艾滋病的诊断，阻碍了抗逆转录病毒疗法的启动和定期监测。短时间准确诊断HIV感染以及筛查出携带HIV感染患者是关键，是感染患者进入治疗级联的切入点，从而确保感染人群的高存活率并大大减少病毒的传播。2018年我国艾滋病疫情评估结果显示HIV感染/艾滋病存活人数约125万（110万～140万）。
HIV感染分析主要是对HIV进行检测，常用于HIV检测的临床常见样本：全血、血清、血浆、口腔黏膜渗出液、尿液、干血斑，血清是实验室比较常见的检测样本之一，从患者抽取5 mL的血样，以3000 rpm的转速离心10min以获得血清样本，一般实验室进行初筛检测，需要确诊的需送地区CDC或有资质的确诊实验室。初筛实验室主要的筛查方法有：快速检测、酶联免疫吸附试验、化学发光或免疫荧光试验等方法，检测结果出现有反应性或大于参考区间上限值时，不能出具阳性报告，必须进入复检试验。对初筛有反应的样本，用原试剂双孔或双份，或者两种不同试剂进行复检试验。如均有反应或一有反应一无反应，报告“HIV感染待确定”。然后进行确认实验，采用蛋白质印迹（HIV 2.2 WB，Genelabs Diagnostics，Singapore）分析和HIV核酸定量或定性检测。对确诊的HIV感染病例还需进行CD4+T细胞计数和病毒载量检测来判断病情疗效和预后。还可通过血清LAg-EIA测定对近期感染状态进行分类。如果初次测试结果为有反应，则由医生提供结果通知和测试后咨询。
对于HIV感染检测结果呈阳性的患者，检测后咨询则应包括心理健康辅导和个人健康教育，以及标准化的医疗和预防护理转诊。在初次随访期间对所有在急诊室就诊期间检测出HIV感染呈阳性的患者进行确认性试验。艾滋病的实验室检查主要是进行中度以上细胞免疫缺陷分析，即CD4+T细胞耗竭：T细胞功能下降，外周血淋巴细胞显著减少，CD4＜200/μL，CD4/CD8＜1.0（正常人为1.25～2.1），迟发型变态反应皮试阴性，和有丝分裂原刺激反应低等。
HIV感染的实验室检测在HIV感染诊断、疾病进展监测、抗病毒治疗疗效评价和HIV耐药监测中至关重要。值得强调的是临床上患者一旦涉及HIV感染，其检测手段和内容主要涉及HIV抗体检测、HIV-1 p24抗原检测、HIV RNA病毒载量检测、CD4+T细胞计数和HIV耐药检测等，任何单一的检测方法都有一定的局限性，应该根据实验室不同类型的检测方法和临床表现来综合诊疗。
1.HIV抗原抗体检测 HIV抗原抗体检测一般用于辅助诊断、血液筛查和监测，实验室常常选择经国家药品监督管理局注册且在有效期内的试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的方法及试剂。HIV抗体检测分为筛查试验和确认试验，可用于诊断（确定个体HIV感染状况）、监测（了解不同人群HIV感染率及其变化趋势）及血液筛查（防止输血传播HIV）。抗体筛查试验根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、快速凝集法和层析法、化学发光或免疫荧光试验。HIV快速检测在20年代初开始投入使用，用于外科手术之前快速检测患者血清状态。开发的第一个HIV快速检测方法是微基因凝集试验和Abbott Murex单次使用诊断系统，但是存在很高的假阳性和假阴性率。后来一些检测平台的出现提高了检测的准确性，例如流式细胞仪（Insti HIV-1/2）和改良的凝集测定等。这些平台的出现能够保证在30 min中内获得检测结果。按照不同品牌的试剂盒可选用免疫层析试验、明胶颗粒凝集试验和免疫渗滤试验等技术。快速检测法的优势是即使没有经过专业培训的非实验室工作人员也可进行操作。自1985年第一代ELISA试剂问世以来，随着医学技术的发展，到20世纪80年代中后期，基因工程技术迅速发展，DNA重组和多肽合成技术出现。到20世纪90年代，包被抗原已从第一代的全病毒裂解物发展为目前以基因重组和多肽抗原包被和标记、有着良好灵敏度和特异度的第三代双抗原夹心试剂。第三代试剂检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型，窗口期由10周缩短至3～4周。再到如今的第四代和四代+的出现，可以同时检测HIV抗体和HIV p24抗原，提高了检测灵敏度；检测结果能够区分HIV抗体和p24抗原，更有利于判断HIV感染的阶段。该种试剂在临床诊断、血液筛查等领域得到了广泛应用。目前疑似HIV感染者常见HIV抗原抗体检测包括有HIV自我检测平台和HIV感染初筛和确认实验等。
（1）HIV自我检测（HIV self-testing，HST）：这是全球都在推广的扩大检测的有效手段。HIV自我检测是一种创新方法，可用于接触HIV感染高危人群的检测。美国FDA批准了使用全血作为样本的Autotest VIH和Inst HIV-1/2抗体检测，使用口腔分泌物的OraQuick Advance口腔液HIV-1/2抗体检测。用户可以自行在药店购买测试试剂盒，利用指尖血或口腔黏膜液进行检测，按照说明书结果判断标准来确定自己是否感染。没有经过任何专业培训的受试者可以在更加私密和方便的环境中来检测感染状况，并在20 min内得到结果。
（2）HIV抗体初筛试验
1）快速检测（rapid Test，RT）：主要用于艾滋病门急诊、普通实验室检测、血液筛查和按需查体等，为了快速筛查HIV感染状况。可检测单独抗体或抗原，也可检测抗体抗原等，操作简单便捷，按照试剂说明书进行检测即可。按照不同品牌的试剂盒可选用免疫层析试验、明胶颗粒凝集试验和免疫渗滤试验等技术。
2）酶联免疫吸附试验（ELISA）：主要用于实验室和体检筛查等，需要酶标仪，将HIV抗原/抗体包被于固相载体，加入待检样本和酶标记的HIV抗原/抗体，加底物显色，用仪器读出OD值，根据cut-off值进行判断得出测定结果。ELISA法具有高敏感度和高特异度，可以将窗口期缩短至21 d，适用于广泛筛查。但是该技术存在一定的局限性，对仪器以及操作人员的专业性要求较高，获取结果的时间长，不适用于需要快速出结果的检测。
3）化学发光或免疫荧光试验（CLIA/IFA）：采用发光或荧光底物，可使用血液（包含血清和血浆）样本中的P24抗原和HIV1/HIV2抗体结合相应的抗体抗原，再与生物标志物进行结合，测量产生的化学发光反应，通过比较化学发光信号和cut-off信号，检测样本中是否有HIV抗原或抗体样本信号的cut-off值，得出结果。既可检测抗体或抗原，也可联合检测抗体抗原（同时检测血液中HIV-1 p24抗原和HIV-1/2抗体）。
（3）HIV-1 p24抗原检测：HIV-1 p24抗原是HIV感染者体内最早出现的病毒蛋白之一，可作为诊断标志物将检测窗口期缩短至14 d左右。HIV-1 p24抗原检测可用于HIV-1抗体不确定时或窗口期的辅助诊断、HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断以及第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断。(https://www.daowen.com)
全国艾滋病检测技术规范（2020修订版）中提到的常规检测方法为酶联免疫吸附试验、电化学发光法、酶联荧光分析法等，通常作为筛查试验。HIV-1 p24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂，在有效期内，其阳性结果必须依据试剂说明书经中和试验确认。HIV-1 p24抗原检测的灵敏度为30%～90%，该结果仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。但其方法受灵敏度限制并不对抗原进行单独检测，而是抗原抗体联合检测。检测结果阴性只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染，临床上一般不作为常规诊断项目。
目前HIV-1 p24的常规检测方法如ELISA检测、超敏酶免疫测定法、免疫复合物解离测定法和化学发光法等可提高检出率。如今针对检测HIV-1 p24抗原的新技术越来越多，像纳米技术在生物传感器方面的应用，已研发出利用金纳米粒子与光等离子体的三明治式免疫的检测方法，检测限为1×10-17g/m L，大大提高了灵敏度；另外，基于生物素耦联的铁蛋白笼形纳米颗粒的研究，利用链霉亲和素与生物素的特异性结合，已应用于HIV-1 p24抗原的酶联免疫吸附试验。
（4）HIV感染确认试验：主要采用免疫印迹试验（Western Blot，WB）。它由各地区有资质的CDC和HIV确诊实验室完成，主要用于初筛抗原抗体有反应性的样本。根据病毒蛋白的分子量不一样，用醋酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活的HIV-1型病毒单板的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽，在醋酸纤维试剂膜条分别加入稀释的血清或者血浆样本或对照进行孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性抗体，则抗体会与试剂膜条上的HIV-1单板和HIV-2多肽结合，通过清洗去除试剂条上的未结合物，与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷酸酶的抗人IgG抗体结合，加入底物等一系列反应即可显色。
WB是一种高度准确的诊断方法，但是操作繁琐需要专业的人员进行操作，整体的诊断成本较高，一般不适宜用于大规模的筛查，适用于与其他检测手段结合使用，是一种确认型的检验手段。自1985年，第一个HIV抗体检测试剂问世，用于筛查血液制品。在过去快40年中，伴随着艾滋病防治的需要、对HIV感染和病毒学认识的不断深入及分子生物学技术的进步，HIV血清学检测方法有了长足的进展，目前已经发展到“第5代试剂”，但是由于在一项检测中同时结合抗体、抗原两种成分，增加了相互的干扰，影响了检测的灵敏度和特异度，特别是p24的灵敏度。用其检测血清阳转前后的标本，如果p24抗原水平下降，HIV抗体尚未上升至检测限，还可能出现“第二窗口期”。此外，第四代试剂筛查阳性后，还须通过确认试验及p24抗原检测才能确定是抗体还是抗原阳性，操作的复杂性也限制了其在临床的应用。
2.HIV RNA载量检测 世界卫生组织强烈建议在监测抗逆转录病毒和确认治疗效果时使用病毒载量（VL）检测。目前的HIV检测方法中，基于抗体的血清学检测窗口期为20～30 d，而核酸检测可将窗口期缩短至10 d左右。HIV载量检测可用于辅助诊断HIV感染、监控病程、指导治疗方案、判定疗效、预测疾病进展等方面。
值得注意的是，每一种HIV RNA定量系统都有其最低检测限，即可以测出的最低拷贝数。RNA定量检测时未测出不等于样品中不含有HIV RNA；HIV RNA定性检测阴性只报告本次实验结果为阴性，但不能排除HIV感染；HIV RNA定性检测阳性可作为诊断HIV感染的辅助指标，不能单独用于HIV感染的诊断。
常用的HIV载量检测方法包括逆转录PCR检测、核酸序列扩增试验和分支DNA杂交试验。虽然不同的检测方法之间具有一定的可比性，但目前尚无法将不同仪器的检测结果统一标准化，因此，建议在对同一位感染者进行随访或评价其治疗效果时，尽量采用同种方法。病毒载量检测的主要进展为实时荧光定量PCR法，通过荧光标记探针，进行累积产物的实时检测，减少了操作步骤，具有更宽的线性范围，降低了残留物污染的风险。该方法不仅提高了检测血浆病毒载量的速度和灵敏度，还可检测外周血单个核细胞中的前病毒含量；此外，其可在同一平台进行其他病毒如HBV、HCV等的检测，对于艾滋病合并感染疾病的诊断具有参考意义。
随着技术的不断发展，研究人员不断开发出在有限的环境中脱离高试验要求的核酸检测技术。包括环介导的等温扩增技术（loop-mediate isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RAP）等。使用LAMP可以用于HIV急性检测，窗口期要比快速检测短1～3周。RAP不需要对DNA样品进行预处理或者热变形，体温即可催化RAP，15 min即可完成样本的检测。另外，基于成簇的规律间隔的短回文序列（CRISPR）与反转录重组酶介导的等温扩增（RTRAA）技术检测HIV的方法，在HIV的即时检测中发挥着巨大潜力。
3.CD4+T细胞计数 CD4+T细胞是人体免疫系统最重要的细胞之一。HIV以CD4+T细胞为靶细胞，HIV感染后可导致CD4+T细胞数进行性下降，使机体免疫功能受损，患者最终因机会性感染及肿瘤而死亡。CD4+T细胞绝对值的检测在HIV感染的以下方面发挥了重要作用：了解机体的免疫状态以确定疾病分期，监测疾病进程，评估疾病预后，制定抗病毒治疗方案及机会性感染预防性治疗方案，评估抗病毒治疗疗效等。目前，用于CD4+T细胞检测的方法分为自动检测方法和手工操作方法。自动检测方法主要是应用流式细胞仪或专门的细胞计数仪。手工操作方法则需要显微镜或酶联免疫试验设备。目前，检测CD4+T细胞计数的标准方法为利用流式细胞仪得出CD4、CD8细胞的绝对值及占淋巴细胞数量的百分比。
4.HIV耐药检测 HIV耐药性检测方法主要有基因型耐药检测和表型耐药检测。基因型耐药检测的灵敏度因所用的方法不同导致范围有所不同，在血浆HIV-1 RNA低水平，基因型耐药检测很可能体现出唯一的病毒变种。表型耐药检测利用体外药敏方法，即利用梯度稀释的抗逆转录病毒药物处理细胞后对病毒复制能力进行直接的评价，结果通过50%抑制浓度（IC50）及其倍数改变（fold change，FC）来评估耐药程度。目前有许多重组病毒或假病毒的表型耐药检测方法，但没有一种方法可以同时满足对病毒所有酶区、所有药物靶点及其相互作用检测的要求。基于以上多种原因，有专家设计了基于Gateway重组技术成功构建包含LTRgagpol整体序列的载体HIV-1表型耐药检测载体构建方法及试剂盒，并且该LTRgagpol序列具有通过限制性内切酶被拆分成几部分任意单独扩增的特点，这样可以通过组合扩增有效地完成涵盖所有耐药靶点的基因构建，通过单次耐药检测完成对多种药物的检测。正是采用上述设计和技术，成功构建了检测HIV-1逆转录酶、蛋白酶和整合酶抑制剂等的表型耐药检测系统，通过将经过扩增纯化的患者基因片段插入到T载体上，得到单克隆质粒，再将酶切后的质粒连接到载体上，经入门载体转移到表达载体上，从而得到含有患者基因的骨架质粒，骨架质粒与包膜质粒共感染293T细胞得到假病毒，再经药物抑制试验最终得到表型耐药结果，实现这一新型HIV-1表型耐药体系的临床检测应用研究。
HIV的临床实验室检测在艾滋病防治中十分重要。我们要在HIV检测的试剂盒开发上提出更高的要求，在兼顾检测效率与降低成本之外，还要提高检测的灵敏度与特异性，满足临床需求，更好地服务于艾滋病防治工作。