【基本概念】

大肠菌群、MPN

【重点内容】

1．大肠菌群测定的食品卫生学意义。

2．大肠菌群的检验方法、大肠菌群MPN的测定方法和报告方式。

【教学目标】

1．知识目标

熟悉大肠菌群的定义，知道大肠菌群测定的食品卫生学意义；学习并掌握大肠菌群的检验方法。

2．技能目标

掌握大肠菌群MPN的测定方法和报告方式；熟悉检验中各种培养基的制备。

资 料 单

1．大肠菌群的定义

大肠菌群是指在36 ℃条件下培养48 h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

大肠菌群最可能数是以每100　mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

2．食品卫生微生物检验大肠菌群计数国家标准的适用范围

食品卫生微生物检验大肠菌群计数国家标准适用于各类食品大肠菌群的计数。

3．大肠菌群测定的食品卫生学意义

大肠菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能，具有广泛的食品卫生学意义。

技 能 单

一、材料与设备

1．样品

乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。

2．菌种

大肠埃希氏菌、产气肠杆菌。

3．其他仪器

恒温箱、恒温水浴箱、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、药物天平、乳钵、剪子和镊子、稀释液、乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、EMB琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液等。

二、流程

样品处理→乳糖发酵试验→分离培养→证实试验。

三、方法与步骤

（一）样品处理

（1）无菌操作取样。液体样品取检样25 mL，放于225 mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，固体样品取检25 g置于灭菌乳钵内剪碎或研磨后，最好置于灭菌均质器以8 000～10 000 r/min的速度处理1 min。后放于225 mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，经充分振摇，制成1∶10的均匀稀释液。

（2）用1 mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1 mL，沿管壁缓慢注入含有9 mL灭菌生理盐水的试管，振摇试管混合均匀，制成1∶100的稀释液。

（3）另取1 mL灭菌吸管，按上一步操作，制成10倍递增稀释液，直到符合所需稀释度。

（4）根据对样品污染情况的估计，选择3个适宜稀释度。

（二）乳糖发酵试验

所选每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种接种于1支乳糖胆盐发酵管中做对照。置于37 ℃恒温箱，培养24 h，如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。乳糖发酵产气现象如图3-17所示。

图3-17 乳糖发酵产气现象

（三）分离培养及证实试验

将产气发酵管中的培养物在伊红美蓝琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离，然后置于37 ℃恒温箱，培养24 h后取出，观察平板上有无黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。如有典型菌落形成，则挑取可疑大肠菌落1或2个进行革兰氏染色镜检，同时接种乳糖发酵管，置于37 ℃恒温箱，培养24 h后，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性，否则为大肠菌群阴性。(www.daowen.com)

（四）报告（左图不产气、右图产气）

证实为大肠菌群阳性后，根据乳糖胆盐阳性的管数，查MPN表，报告每100 mL（g）大肠菌群的MPN值。

四、实训报告

根据食品检样测定的方法、结果，报告被检食品的大肠菌群MPN，并对检样进行卫生评价。大肠菌群最可能数（MPN检索表）见表3-2。

表3-2　 大肠菌群最可能数（MPN检索表）

续表

续表

作 业 单

一、填空

1．大肠菌群包括（　　）、（　　）、（　　）、（　　）等属。

2．在大肠菌群计数时，若大肠菌群为阳性，镜检时应能看到革兰氏染色为（　　）性的（　　）芽孢杆菌。

二、简答

1．大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管?

2．做空白对照试验的目的是什么?

3．为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实?

4．复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐?

评 估 单

【评估内容】

一、名词解释

1．大肠菌群　2．大肠菌群近似值MPN

二、判断

大肠菌群胆盐乳糖发酵时产酸产气，但仅仅乳糖发酵时只产酸不产气。　　　（　　）

三、简答

1．简述大肠菌群测定的食品卫生学意义。

2．简述大肠菌群近似值MPN值的测定方法。

四、操作

各小组进行饮用水中大肠菌群的测定，并写出检验报告。

【评估方法】

以小组为单位进行评估。主要是在试验过程中进行，检查各小组是否掌握大肠菌群的测定方法及操作步骤，同时对各小组人员随机抽取2人进行提问，提问分数以2人平均分数计。

优：小组能独立正确地完成各项工作，并正确回答问题。

良：小组能独立正确地完成大部分工作，个别环节仍需提示才能完成。

及格：小组能基本完成大部分工作，其他环节有错误。

不及格：小组不能独立完成各项工作。

备注：项目十七任务三学习情境占模块三总分的14%。