硫化氢保护核黄素溶菌酶光损伤

溶菌酶（Lyso）是一个含有129个氨基酸残基的蛋白酶，分子量为14.6KDa它包括3个酪氨酸残基和6个色氨酸残基，其中4个色氨酸残基暴露在溶剂中。Lyso是研究蛋白质氧化损伤的一个非常好的模型，它在可见光范围内几乎没有吸收，结构与组成已经确定，且蛋白质结构稳定［184］。已有许多研究使用Lyso作为模型研究蛋白质的光损伤和氧化损伤［130-134，185，186］。其中一些研究表明，ROS与Lyso的反应是通过与Lyso的Tyr和Trp残基作用进行的［130，131］。

关于RF诱导的Lyso光损伤，已报道的文献表明，在可见光和RF的作用下，Lyso能够经过裂解和聚合过程，形成二聚和多聚产物，Lyso光损伤的程度受光照强度和时间、RF用量，体系O2含量等因素的影响［187，188］。总之RF诱导的Lyso光损伤是一个研究比较成熟的模型。本文正是使用该模型从宏观层面考察H（2）S对RF诱导的Lyso光损伤的保护作用。从图7-9中可以看出，Lyso和H（2）S在大于330nm的波段没有吸收，因此在Lyso，RF和H（2）S构成的三元反应体系中，330～500nm范围内的光源能量主要被RF吸收。我们首先考察了在没有H（2）S保护的情况下，RF诱导的Lyso光损伤的情况。如图7-10A所示的四条电泳条带可以看出，在光和RF存在条件下（泳道4），可以清楚看到Lyso损伤后所生成的二聚体条带（26.0KDa）和更高分子量的聚合条带，没有光照下，RF与Lyso组（泳道3）也会出现微弱的聚合现象，这可能是自然光造成的干扰，而没有RF的情况下（泳道2），所使用光源对Lyso几乎不造成损伤。由此可见，Lyso的光损伤是由RF介导产生的。

图7-9　在pH=7.2的水溶液中，RF（A），Lyso（B）和H（2）S（C）的紫外可见吸收谱图

接着，我们固定光照条件，Lyso（0.25mM）和RF（0.1mM）的用量，在pH=7.2的条件下，通过加入不同浓度的Na2S来比较H（2）S对RF诱导的Lyso光损伤的影响。如图7-10B所示，无论是Lyso的二聚体条带还是更高聚合度的多聚体条带，其灰度均是随着H（2）S的增加而减弱。二聚体条带（26.0KDa）的灰度值变化也能清楚地表明RF诱导的Lyso聚合程度随着H（2）S浓度的增加逐渐减弱（图7-10C）。(https://www.daowen.com)

图7-10　（A）不同条件处理的Lyso经SDS-PAGE实验后所得到的凝胶成像图：泳道1：Lyso对照组；泳道2：Lyso+辐照；泳道3：Lyso+RF（0.1mM）；泳道4：Lyso+RF（0.1mM）+辐照。（B）在Lyso（0.25mM）和RF（0.1mM）的pH=7.2的体系中，分别加入不同浓度Na2S（0mM，0.05mM，0.25mM，0.5mM，1mM，2.5mM和5mM），经辐照所得到的样品进行SDS-PAGE实验后所得的凝胶成像图。（C）图7-10B中二聚体条带（26.0KDa）的灰度值与对应Na2S浓度的关系：以对照组灰度为100%，其他组的值为相应条带灰度值与对照组的百分比（n=3）

瞬态动力学的结果表明，RF吸收UVA和可见光主要发生光激发反应，生成3 RF＊。3 RF＊是氧化能力很强的瞬态物质，它一方面能够通过电子转移的途径直接氧化Trp和Tyr生成TyrO·和TrpN·［189］。另一方面，在有氧条件下，3 RF＊能够与O2发生能量转移反应生成1 O2，1 O2也是氧化能力很强的物质，能够造成蛋白质的氧化损伤［180］。3 RF＊和1 O2对Trp和蛋白质的Trp残基的反应活性比Tyr和蛋白质的Tyr残基更强［132］。一般当一个同时含有Trp和Tyr残基的蛋白质遭受氧化损伤时，Trp残基首先被氧化为TrpN·，然后经过一个分子内的长距离电子转移过程，同一蛋白质分子上的Tyr残基与TrpN·残基发生电子转移，生成TyrO·残基［176］。TyrO·之间能够发生聚合反应，从而造成蛋白质之间的聚合现象［186］。所以，3 RF＊和1 O2是造成Lyso损伤聚合的源头。

3 RF＊与Lyso和O2之间的反应速率常数分别为9.1×108 M-1s-1和4×108 M-1s-1［180，185］。而本文所计算的3 RF＊与H（2）S的反应速率常数在中性条件下为1.5×109 M-1s-1。当有H（2）S存在时，H（2）S与Lyso和O2竞争性地与3 RF＊反应，从反应速率常数的比较可以看出，在这一竞争反应过程中，H（2）S存在着一定的优势。因此，H（2）S可以通过猝灭3 RF＊来减少3 RF＊对Lyso的直接氧化损伤和1 O2的产量，这应该是其保护RF诱导的Lyso光损伤的一条作用途径。此外，上面的实验也表明，H（2）S具有清除TyrO·和TrpN·的能力，因此可以推测，H（2）S对已经生成的TyrO·和TrpN·应该具有修复能力。另外，蛋白质分子内的Tyr残基与TrpN·残基间电子转移反应的速率常数小于105 M-1s-1［176］，远小于TrpN·与H（2）S之间的反应速率常数，因此H（2）S也能够抑制这种蛋白质分子内的电子转移过程，减少引起蛋白质聚合的TyrO·的生成。