磷酸化反应是生物体内的一类重要生化反应，体内的一些代谢调控是通过磷酸化反应而完成的。另外，生物体内的许多分子以磷酸化形式参与到生命过程中，例如醛羧酶催化反应中的磷酸二羟基丙酮，糖基转移酶催化反应中的1-磷酸糖苷等。化学法催化多羟基化合物的磷酸化反应需要采用多步保护和脱保护反应，而酶法催化的磷酸化反应具有区域和立体选择性，可以省去不必要的保护和脱保护反应。

1.ATP的循环再生

磷酸化酶（phosphorylases）属于转移酶类中的激酶（EC.2.7.×.×），它催化高能磷酸化合物中的磷酸基团转移到另一底物分子上。磷酸酶（phosphatases）则为水解酶，可催化磷酸酯水解反应。磷酸化酶催化反应中常用的高能磷酸化合物是三磷酸腺苷（ATP），ATP价格昂贵且不稳定，生物催化的手性合成中一般采用原位再生循环法提供反应所需的ATP。在活细胞中高能磷酸化合物由代谢反应产生，但在体外利用纯酶进行生物催化反应时则必须提供高能磷酸化合物。若按化学计量提供这种辅酶是不经济的，从热力学角度讲也是不适宜的。因为反应过程中会产生无活性辅酶二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP），它们不利于底物磷酸化。因此辅酶ATP必须以催化剂量添加，并在反应过程中通过辅助系统连续不断地使之再生，辅助系统中应含有一种激酶能催化ADP磷酸化为ATP，并维持ATP在催化剂量水平。

氨甲酸激酶（carbamate kinase）能使氨甲酰磷酸分子中的磷酸基团转移到ADP中生成ATP，氨甲酰磷酸可以由氰酸盐与磷酸原位合成。氨甲酰磷酸和其产物氨甲酸在水溶液中不稳定，很容易自发性水解。水解后产生的氨离子会取代激酶分子中的必需离子Mg2+，影响酶的活性，因而使用不多。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase）系统是ATP再生的有效方法之一。PEP在水溶液中较稳定，是一种很强的磷酸化试剂。该方法的缺点是PEP合成过程复杂，并且丙酮酸激酶易被高浓度丙酮酸所抑制。乙酸激酶（acetate kinase）能催化乙酰磷酸中的磷酸基团转移到ADP中生成ATP，乙酰磷酸可由醋酐和磷酸所合成，它在水溶液中稳定性比PEP低，但它的合成容易，价格相对便宜，缺点是乙酸激酶易被乙酸根离子所抑制。甲氧羰基磷酸是一种廉价的非天然磷酸酯，它是一种强的磷酸化试剂，可由氨甲酸激酶或乙酸激酶催化该分子中的磷酸基团转移到ADP中生成ATP，反应释放出甲醇和CO2，甲醇挥发性较大，对酶毒性较小，CO2为气体容易从反应体系中逸出，这将有利于反应的完成。该方法的缺点是甲氧羰基磷酸在水溶液（pH值为7.0）中不稳定，半衰期为20min。

在有些反应中ATP转变为AMP，甚至腺苷，因此在这种反应体系中须添加腺苷激酶使腺苷AR转变为AMP，AMP经腺苷酸激酶催化转化为ADP。ADP再经上述的ATP循环再生法转化为ATP。其他核苷三磷酸（GDP、UTP、CTP）以及相应的2′-脱氧核苷三磷酸也可以利用乙酸激酶和丙酮酸激酶系统循环再生。

由于内源性核苷酸的不稳定，人们合成了它们的类似物以增加稳定性。如用五元碳环取代五元核糖环制成ATP类似物，如芒霉素三磷酸（aristeromycin triphosphate）和6′-氟碳环腺苷三磷酸（6′-fluorocarbocy clic adenosine triphosphate）。它们可作为甘油激酶和己糖激酶的底物用于ATP的循环再生。

2.区域选择性磷酸化(www.daowen.com)

己糖激酶能选择性催化己糖衍生物的6位羟基磷酸化生成己糖-6-磷酸，反应由ATP提供磷酸基团，生成的ADP由内丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸系统循环再生为ATP。葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）本身在G-6-P脱氢酶催化下转化为6-磷酸葡萄糖酸，该反应可用于氧化型NAD（P）+还原再生。同样，NAD+在NAD激酶催化下，由乙酰磷酸提供磷酸基团生成价格昂贵的NADP+。磷酸二羟基丙酮是醛醇缩合反应中的重要底物，它可由化学法或酶法催化合成。化学法合成的产率为60%，而酶法合成的产率可达80%，且产物纯度高、无需分离、可在溶液中直接使用。

5-磷酸-D-核糖-α-1-焦磷酸（5-phospho-D-ribosylα-1-pyrophosphate，PRPP）是嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸从头合成和补救合成途径的重要中间体。采用两步连续的磷酸化反应可以制备PRPP。首先，核糖激酶催化D-核糖转化为核糖-5-磷酸（R-5-P）。然后由PRPP合成酶催化ATP转移焦磷酸基团能R-5-P的1′-位生成PRPP，同时ATP转变为AMP，因此必须添加腺苷酸激酶催化AMP转化为ADP，然后再由丙酮酸激酶催化ADP生成ATP。

3.对映选择性磷酸化反应

甘油激酶不仅能催化天然底物甘油转变为sn-甘油-3-磷酸，而且能催化甘油结构类似物磷酸化，如二羟基丙酮磷酸化（见图4-11）。甘油激酶也能催化仲醇羟基磷酸化，用于潜手性或消旋体仲醇拆分，从而为手性合成提供重要的手性源。

图4-11 二羟基丙酮磷酸化在手性拆分中的应用