随着生物技术的不断发展，获取新的基因成为分子生物学研究的重要内容。目前筛选获得新基因的方法有很多，但均有不足，如基因组减法技术和cDNA文库筛选技术，具有周期长、步骤多等缺点；通过Genbank中的EST拼接出cDNA又有Genbank中的EST是有限的问题，且有些目的基因丰度很低，获取其全长cDNA非常困难。在这种情况下，1988年，由弗罗曼（Frohman）等发明的cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）技术，可以快速获得cDNA的5′和3′端，以其简单、廉价等优势受到越来越多的重视，成为克隆全长cDNA序列最常用的手段。

（一）基本原理

经典的RACE技术主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA的5′和3′端，也叫单边PCR（one-sided PCR）或锚定PCR（anchored PCR）。是在反转录的同时，在5′和3′端加上通用接头引物，然后利用通用引物和基因特异引物进行PCR反应，从而快速获得目的基因cDNA的5′端和3′端。

1.3′-RACE原理　利用mRNA的3′末端的poly A尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo-dT和一个接头组成的接头引物反转录合成标准第一链cDNA，然后，用基因特异引物（Gene Specific Primer，GSP）作为上游引物，以含有部分接头序列的通用引物（Universal Amplication Primer，UAP）为下游引物，通过PCR获得已知序列和poly A尾之间的未知序列，见图7-1。

图7-1　3′-RACE原理图

2.5′-RACE原理　利用mRNA的3′末端的poly A尾巴作为一个引物结合位点，用一个反向的基因特异引物GSP反转录合成标准第一链cDNA，在反转录达到第一链的5′末端时自动加上一个接头，再利用基因特异引物和通用引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5′末端的cDNA片段扩增出来，见图7-2。

（二）技术要点

1.反转录　影响RACE结果的关键是mRNA反转录合成第一链cDNA，在进行反转录的过程中，不完全的cDNA仍然可以用脱氧核糖核酸末端转移酶（TdT）加尾后进行PCR扩增，所以，要使用高质量未被降解的mRNA，尽可能地避免不完全cDNA产生。(www.daowen.com)

2.加尾反应　标准的RACE要求把第一链cDNA用TdT加上一个poly A尾。反转录后，游离的核苷酸会干扰互补同聚物尾与锚引物的杂交，过剩的cDNA引物会降低加尾的效率，还会在下步PCR反应中作为退火和延伸的底物，降低PCR的效率，所以为了加尾成功，必须除去游离的核苷酸和过剩的cDNA引物。方法之一是使用RNA ligase以共价方式把寡核苷酸连在cDNA的5′端或直接连接在起始RNA群上，以绕过TdT介导的cDNA加尾。

图7-2　5′-RACE原理图

3.PCR扩增　RACE技术是为确定未知cDNA序列的，在PCR中引入的突变要最少，为增加PCR反应的产率和特异性，采用热启动PCR等新方法，先把不含模板或模板和聚合酶的其他PCR成分混合，当混合物温度预热到引物退火温度以上再加入这些组分。

（三）RACE技术改进

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进两个方面，具体方法为：一是利用锁定引物合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3′端引入两个简并的核苷酸，使引物定位在poly A尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly A尾任何部位的结合所带来的影响；二是在5′端加尾时，采用poly C代替poly A；三是提高反转录的温度，选择嗜热DNA聚合酶可以消除5′端由于高GC含量导致的mRNA二级结构对反转录的影响。

Matz等在cDNA合成过程中，利用模板转换效应、PCR抑制效应和降落PCR技术，有效地提高了cDNA末端快速扩增的灵敏度，这种经改进的RACE称为SMART RACE。