GST- pull-down实验
在生命体中，许多蛋白质都是通过与其他蛋白的相互作用或参与到蛋白复合体中来发挥其作用。因此，进一步认识蛋白质间的相互作用，对于深入了解细胞中的各种信号通路以及各种生命现象具有重要意义。酵母双杂交是常见的研究蛋白质相互作用的方法，但是由于其过高的假阳性还需要其他的方法来进一步验证。而GST沉降实验（GST-pull-down）即是一种重要的验证可疑蛋白质相互作用并能用于探索新的蛋白质相互作用的有效方法。这种技术能在目的蛋白还没有可用的抗体或当蛋白质抗体干扰蛋白质-蛋白质相互作用的条件下，就对目的蛋白进行大规模文库筛选并鉴定新的相互作用，也能够确定介导这些蛋白质相互作用的特定蛋白质区域。值得注意的是，尽管这种技术因其灵活性已被应用于广泛的生物学问题研究中，但是这种方法只能用于确定体外的蛋白相互作用，对于蛋白质在细胞中的相互作用研究，还需要如免疫共沉淀等体内实验加以证实。
GST标签是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26ku。GST是一个高度可溶的蛋白，能够有效地增加外源蛋白的可溶性；同时其还能够在大肠埃希菌中大量表达，起到促进目的蛋白表达量提高的作用。在GST沉降实验中，利用和谷胱甘肽球珠结合的GST融合蛋白作为诱饵来捕捉蛋白混合液中的靶蛋白，蛋白混合液可以来自细胞裂解液、蛋白表达系统以及体外转录／翻译系统。GST沉降实验通常有两种应用：证实探针蛋白和已知蛋白质间可疑的相互作用以及确定已知蛋白和未知蛋白的相互作用。
在用GST沉降实验证实可疑的蛋白质相互作用中，常常利用蛋白表达系统表达的蛋白质作为靶蛋白。这就让研究者能够应用比内源蛋白更多量的靶蛋白来研究疑似的蛋白质相互作用，这能够提高检验疑似蛋白质相互作用的灵敏性，但也会带来假阳性率的升高。在验证可疑相互作用的研究中，常常选用蛋白表达系统的裂解物，如E．coil表达系统、病毒感染的真核细胞表达系统、体外转录／翻译系统以及纯化后的靶蛋白（图9-8）。
在用GST沉降实验研究未知蛋白质相互作用过程中，往往需要得到足够的内源性蛋白作为靶蛋白混合液的来源，任何内源性表达的蛋白都能够作为靶蛋白混合液，甚至可以是生物体的体液，如血液、肠分泌物都可以作为靶蛋白混合液的来源。
图9-8 GST沉降实验用于证实可疑的蛋白质相互作用
在GST沉降实验中需要注意几个相关问题。
（一）结合过程中的参数
发现和证实蛋白质的相互作用，与这些蛋白质在自然状态下相互作用的稳定程度密切相关。这种稳定程度决定了采用什么样的体外结合条件。在自然状态下那些参与细胞结构的蛋白质相互作用往往是极其稳定的，而在酶作用或蛋白转运过程中出现的蛋白质相互作用却短暂而不稳定。(https://www.daowen.com)
稳定的蛋白质相互作用能够在较长的时间中仍保持相互作用关系，是最容易用GST沉降实验证实或发现的蛋白质相互作用。对于这些较强的蛋白质相互作用我们可以在较广泛的结合条件下得到结果，往往常选用强离子浓度的缓冲体系避免非特异的蛋白质相互作用，从而降低假阳性的出现。如果蛋白复合体相互作用较弱，具有较高的解离常数，那么我们常通过pH、离子强度以及不同的缓冲体系来调整蛋白质的体外相互作用体系。
用GST沉降实验来证实和探索自然中短暂而弱的蛋白质相互作用，则是一项较为困难的实验。这种蛋白质的相互作用往往很难用GST沉降实验类似的方法来完成。因为在实验过程中这种蛋白质相互作用很可能就发生了解离。而这种短暂而弱的相互作用往往发生在酶发挥活性和蛋白质的转运过程中，在这些过程中常需要其他辅助因子的存在，以及能量的参与［如NTP（nucleotide triphosphates）的水解产生的能量］。因此，要用GST沉降实验完成短暂而弱的蛋白质相互作用分析，就应该在反应体系中加入恰当的辅助因子以及能量，模拟一个和自然状态很接近的相互作用体系。
（二）蛋白复合物的洗脱
在鉴定诱饵蛋白和靶蛋白过程中，需要将蛋白复合物从标签蛋白发挥亲和作用的基质上洗脱下来，SDS-PAGE的上样缓冲液和标签蛋白的竞争物都能够作为洗脱工作液。SDSPAGE的上样缓冲液作为洗脱工作液往往具有更强的洗脱能力，但是也会导致蛋白复合物的变性。另外，上样缓冲液可以从基质上洗脱下能和亲和基质发生强相互作用的非特异结合蛋白质以及导致基质的脱落，这些都会影响后续的鉴定分析。而标签蛋白竞争性洗脱工作液，能够特异地洗脱下诱饵蛋白-靶蛋白复合物，而且还是一种非变性的洗脱方法，能够保持蛋白质复合体的自然空间状态，有利于某些随后的分析。
另外一种洗脱方法能够选择地将靶蛋白洗脱下来，而保持诱饵蛋白仍和亲和基质相连。这种方法常采用步进式地增强盐离子浓度或降低pH。这种方法也是一种蛋白质非失活的洗脱方法，同时还能够提供蛋白质相互作用强弱的相关消息。
（三）沉降实验中对照的设立
在所有沉降实验中对照实验的设立都是必需的。在阴性对照实验中只加入亲和基质和靶蛋白混合液，而不加诱饵蛋白，从而能够帮助排除和亲和基质发生非特异结合的假阳性。在另一组阴性对照实验组中，只有亲和基质、诱饵蛋白和无靶蛋白的蛋白混合液，从而能够帮助排除和诱饵蛋白中的标签蛋白非特异结合的假阳性，这一组对照实验组也能够作为阳性对照，说明亲和基质能够有效地捕捉带标签的融合诱饵蛋白。
