Far- Western blot实验

第五节　Far- Western blot实验

Far-Western blot技术最初在20世纪90年代初被发明。当时是因为研究人员想要将其用作32P标记的谷胱甘肽S-转移酶（GST）-融合蛋白表达文库的筛选，现在Far-Western印迹则更多地被用于检测蛋白质-蛋白质相互作用，其原理和经典的Western blot非常类似。

从理论上来说，蛋白之间的相互作用很大程度上是依靠于其二级和三级结构，而众所周知，在SDS-PAGE胶中进行电泳的过程中蛋白基本是处于还原和变性的状态。所以，在经历过SDS-PAGE的常规上样buffer处理后的蛋白质应该不太可能还彼此之间发生相互作用。但是，自然的神奇还不是我们可以完全理解的。在很多情况下，这些经过了严酷的SDSPAGE过程的蛋白质依然能以很高的亲和力发生相互作用。而这种现象，既是Western blot的作用基础，也成了人们发明Far-Western的灵感来源。

Far-Western blot和Western blot的基本步骤非常类似，就像我们在图9-9看到的，二者单纯从技术步骤上来说基本没有区别，两者间的区别在于检测目的的不同。Western blot是使用已经确定发生的相互作用来检测是否有目标蛋白的存在，而Far-Western blot是在已经确定的蛋白个体之间检测它们相互作用的可能性。

Western blot和Far-Western blot的区别在于：经典的Far-Western blot首先需要原核表达探针蛋白，并利用融合表达的探针蛋白上面带有的GST标签将其尽可能地纯化。

在经典的Far-Western blot中采用的蛋白探针结构包含目标蛋白框架内的GST成分、蛋白酶切割位点以及一种已知蛋白激酶的靶部位（图9-10）。首先，在谷胱甘肽球珠上利用GST标签将探针蛋白富集纯化，然后用商品化的蛋白质激酶对纯化的蛋白进行32 P标记。洗脱未标记的核酸后，人们用还原型谷胱甘肽洗脱标记的融合蛋白探针，或者为了避免后续步骤中的假阳性，有时候人们也会用蛋白酶（与融合蛋白上带有的酶切位点相符）切下标记后的蛋白。有时候在一些验证特定蛋白之间的试验中，人们也会将待测蛋白体外表达，并利用His等标签来纯化（图9-11）。

Far-Western blot中对待测样品的处理和Western blot中一样，都是通过SDS-PAGE胶来进行分离，然后将分离成单一组分的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，经过清洗和封闭，然后等待下一步探针蛋白的加入。加入探针蛋白后经过适当时间的孵育，洗膜后进行放射自显影，一个经典的Far-Western blot就算完成了。

近几年来研究人员已经在Far-Western blot技术的试验材料和试验细节上做出了很多改进。人们发展了除放射自显影之外其他更安全的检测策略，比较常用的如：1）用抗GST抗体定位Far-Western blot中的非标记融合蛋白；2）通过链亲和素偶联的酶来检测生物素标记的GST。这两种方法一般用于小规模的检测，在使用Far-Western blot进行文库筛选时，出于成本的考虑，人们一般还是选择传统的放射自显影方法。随着生物科技的进步，Far-Western blot技术也更多地被用于检测受体-配体相互作用以及相互作用蛋白文库的筛选。借助这种分析方法，使许多研究变成可能，如翻译后修饰对蛋白质-蛋白质相互作用的影响，用合成的多肽作探针检测蛋白相互作用的序列，以及在无抗原特异性抗体的情况下识别蛋白质-蛋白质相互作用。