9．2 研究方法
9．2．1 研究设计
“2002年中国20～60岁一般健康男性精液质量及其环境影响因素”研究项目对研究人员进行了统一培训，统一了研究方法。该项目对研究对象进行了结构式问卷调查、外生殖器检查，并统一标准留取精液进行精液分析，采用流式细胞术分析精液DNA指标。
问卷调查内容包括：一般人口学特征、性发育及生育／不育史、吸烟情况（是否吸烟、开始吸烟年龄、每日吸烟支数、吸烟年数等），以及生活习惯和环境、农药或毒物接触及疾病用药史、电器使用情况等。
外生殖器检查内容包括：阴囊、阴茎、睾丸、附睾、输精管、精索静脉等。该研究排除有泌尿、外生殖器疾患者入选为研究对象。
精液标本搜集与分析：研究要求对象取精前禁欲3～6天，各研究中心设有专门的取精室，采用手淫法取精。精液分析统一按照WHO《人类精液及精子—宫颈粘液相互作用实验室检测手册》第四版（2001年）推荐的检测方法，主要检测的精液指标有：外观、粘稠度、液化时间、pH值、凝集状况、精液量、精子密度、总精子数、精子活动力分级、精子存活率、精子形态。同时，该研究还采用流式细胞术对精液DNA指标进行检测，以计算精液中单倍体精子、二倍体细胞，以及其他各级分化细胞。
9．2．2 精液DNA指标的监测
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是对细胞的理化性质，如细胞大小、胞质内颗粒的多少、DNA及RNA含量、细胞表面标志、薄膜上及胞质内受体、细胞蛋白质及酶的质和量等进行自动化分析、快速测量，并可分类收集的一种高科学技术。它集激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等多门科学于一体，具有快速、简单、客观、可靠等优点，能同时进行多参数相关的测量，并能对细胞进行分选。20世纪90年代以来，FCM在临床医学中，广泛应用于不孕不育人群的精液研究。检测的项目包括：①检测精子顶体结构及顶体反应能力；②检测精子染色质缩合度；③检测线粒体功能；④检测抗精子抗体（AsAb）；⑤检测精子凋亡；⑥用于X和Y精子的分选；⑦分析精液中的脱落细胞；⑧检测精子DNA断裂及对DNA原位变性的敏感性。
流式细胞术可确定各种细胞群的相对比例：成熟的单倍体精子及异常成熟的双倍体精子、细胞碎片、未成熟的胚细胞（单倍体圆形精子细胞、双倍体细胞、S期及4C细胞）和白细胞等。Hacker－Klom等［21］采用流式细胞术及传统显微技术分析了155例不育患者的171份精液标本，结果发现显微技术和流式细胞术所测的精子浓度呈直线相关，所获8种直方图（每一种为不同的精子片段及其他颗粒）与精子发生图结果相符。在10年随访中发现，低浓度精子或高浓度细胞碎片的两组病人表现出明显的生育减弱，双倍体精子≥5%及精子染色质浓缩不良的两组病人生育能力也明显低下。张健宁等［22］对82例不育男性的研究发现，不育男性精液中单倍体的成熟精子减少，亚单倍体细胞碎片和凋亡细胞增多，大于二倍体细胞增多。DNA流式细胞术可提供其他方法不易获得的信息，并具有操作及诊断快的优点。但目前应用流式细胞术检测精液中DNA倍体的情况仅限于小样本的不育人群，吸烟对精子DNA倍体比例的影响未见报道。
精液DNA指标的检测（图9．1）：精液样本由一名高级技师采用流式细胞术统一检测精液DNA指标。将精液标本用PBS（磷酸缓冲液）洗2次（500r／min，5分钟），然后用75%乙醇固定20分钟，再用PBS洗2次，用碱化丙啶（PI）一步法荧光法染色（染色试剂盒为美国BD公司产品），在FACS Vantage SE型流式细胞仪（美国BD公司产品）上检测，激发波波长为488nm。在检测过程中，待测细胞首先被制成单个细胞悬液，然后用荧光染料（碱化丙啶，PI）使细胞着色，着色的量和DNA含量成正比。染色的单细胞悬液在高压氮气的驱动下，在特制的样品管中流动，细胞一个个依次进入50～100μm小孔，通过激光束的焦斑区时，产生信号。信号被摄取处理后，可以计算出碎片及凋亡细胞、单倍体精子、单倍体与二倍体之间的各级分化细胞、二倍体细胞、大于二倍体的细胞的比例。
图9．1 流式细胞术检测的精液中DNA指标的分布（A，正常精液；B，异常精液）
All：检测的所有细胞数，M1：碎片及凋亡细胞，M2：单倍体精子，M3：单倍体和二倍体之间的各级分化细胞，M4：二倍体细胞，M5：大于二倍体细胞。
正常精液单倍体精子所占比例较高（＞90%），而异常时单倍体精子所占比例降低，碎片细胞、二倍体及多倍体细胞的比例可能增加。(https://www.daowen.com)
9．2．3 质量控制
该研究中采取多种措施进行质量控制，以保证高质量研究结果：①采用统一的调查问卷、精液采集和分析方法；②研究开始前对相关研究人员进行集中、严格的培训，统一问卷的填写标准；③各中心固定专门的男科学医师进行统一的外生殖器检查，固定专门的实验室技师进行精液分析；④精液DNA分析由南京医科大学生殖医学重点实验室的一名高级实验技师进行；⑤研究过程中严格执行对象的筛选条件和精液采集条件；⑥在研究过程中，定期召开质控会议，研究负责人进行定期的现场巡视，以进一步统一标准；⑦由双人分别进行双遍问卷的编码和录入，并进行逻辑校对。
9．2．4 数据管理与分析方法
该研究所有的调查问卷均由经过培训的人员进行统一编码，用Epi－info软件建立数据库，进行双人双遍数据录入并进行校对，双遍数据完全一致后转换为SAS数据库并进行逻辑校对。固定数据库后采用SAS8．02软件包进行统计分析。
（1）吸烟与精液质量关联分析框架
1）首先对吸烟和非吸烟组对象的地区分布、一般人口学特征、性发育和生育状况、生活习惯和有毒有害物质接触、电器使用等因素进行比较。然后，对吸烟对象的吸烟情况，包括开始吸烟年龄、每日吸烟支数、吸烟年数及总吸烟剂量等进行描述。
2）采用方差分析的方法，对不同特征对象的5个精液常规指标（包括精液量、精子密度、精子存活率、精子前向运动率和精子正常形态率）的均数进行了比较，并采用混合线性模型调整地区与年龄因素后，分析精液常规指标可能的影响因素。
3）将对象的吸烟状况指标分为4个吸烟组别：①是否吸烟；②吸烟年数组：不吸烟组、吸烟＜15年、吸烟15年～、吸烟≥25年；③每日吸烟支数组：不吸烟组、吸烟＜10支，吸烟10支～，吸烟≥20支；④总吸烟量组：不吸烟组、吸烟＜7万支，吸烟7～15万支，吸烟≥15万支（总吸烟量的计算：吸烟年数×365×每日吸烟支数）。
4）对不同吸烟组别的5个精液常规指标的比较，分析策略为：①分别采用方差分析方法分析各组别均数间的差异，若有统计学差异，校正地区和年龄后作协方差分析，并计算校正后的均数；②在分析了4个吸烟组别对5个精液常规指标均数影响的基础上，将5个精液常规指标以其P20进行两分类，分为是否正常，采用卡方检验和单因素logistic回归分析的方法分析吸烟对常规指标异常比例的影响；③以精液常规指标是否正常为应变量，在调整可能的6个混杂因素：中心、年龄组、禁欲时间、文化程度、饮酒和接触农药后，分别按降序拟合多因素logistic回归的4个模型，分析吸烟和不同吸烟剂量对精液常规指标的影响及其影响程度。模型1、模型2、模型3及模型4中的吸烟状况变量依次是：是否吸烟、吸烟年数组、每日吸烟支数组及总吸烟量组；④将对象开始吸烟年龄、吸烟年数、吸烟支数、总吸烟量及精液常规指标进行秩转换，然后进行吸烟与常规指标的Pearson相关分析。
（2）吸烟与精液DNA指标关联分析：采用流式细胞术检测的精液DNA指标包括碎片及凋亡细胞、单倍体精子、单倍体和二倍体之间的各级分化细胞、二倍体细胞、大于二倍体细胞，这5个指标均为非正态分布，5个指标之和为100%，其中最为重要的是单倍体精子。由于5个指标之间有一定的相关性，一个指标有变化，其他指标都可能随之变化，因此，研究未对所有的5个指标均进行分析，只对单倍体精子的比例、二倍体细胞的比例和大于二倍体细胞的比例进行了分析。分析策略如下：
1）采用非参数检验的方法分别对是否吸烟两组的单倍体精子比例、二倍体细胞比例和大于二倍体细胞比例进行比较，并分析了单倍体精子比例、二倍体细胞比例和大于二倍体细胞比例可能的影响因素。
2）按照实验室推荐的正常参考值将其分为正常和异常，比较吸烟和非吸烟两组精液DNA指标正常率的差异。
3）分别将单倍体精子的比例、二倍体细胞的比例和大于二倍体细胞的比例以P25、P50、P75为界点，分为四组，分别拟合单因素和多因素logistic回归模型，以探讨是否吸烟对精液DNA指标的影响。多因素分析的调整因素包括年龄、农药接触、饮茶、电器个数和饮酒。
4）并将相关吸烟指标分为不同的剂量组，分别拟合单因素和多因素logistic回归模型，探讨吸烟和精液DNA指标之间可能存在的剂量反应关系。
