附录1 中国男性精液质量现状及环境影响因素的研究（研究文本）
国家高技术应用部门发展项目可行性研究报告
项目名称：中国男性精液质量现状及环境影响因素的研究
承担单位：上海市计划生育科学研究所
合作单位：国家计划生育委员会科学技术研究所
南京医科大学
上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）
主管部门：国家计划生育委员会
编制日期：2000年10月6日
1．项目提出的背景和必要性，所依据的前期科研和工作基础，产品和技术的市场需求预测
1．1 项目提出的背景和必要性
在控制人口数量的同时，人口素质问题越来越引起人们的重视。由于繁衍子代的过程主要由妇女来完成，因此自20世纪40年代以来，人们对外环境中各种有害因素，以及女性生殖功能和子代发育不良影响的认识日益深入。相比之下，父亲接触有害因素对生殖功能和子代健康的潜在危害长期被忽略。直到20世纪70年代末，人们才逐渐注意到滥用药物、吸毒、接触化学物质等可致男性不育或影响子代健康。进入20世纪90年代以来，有关男性精液质量与环境质量关系报告日趋增多。1991年在丹麦举行的“环境对生殖健康影响的国际研讨会”及1992年在巴西举行的“环境与发展”首脑会议指出：全球性的人类精液质量正在下降，环境污染日趋严重，如不采取积极的措施，将对人类自身的生存造成难以预测的严重危险。江泽民主席在中央计划生育和环境保护工作座谈会上指出“计划生育和环境保护工作有着密切的联系”，反映了国际、国内社会对环境因素与人类生殖健康关系课题的极大重视。
生殖是人类得以繁衍的最重要的生物事件，任何威胁生殖功能的征兆不仅引起科学界的高度关注，也会引起公共媒介的强烈反响。男性生殖功能包括：精子发生、精子成熟、精子排出，以及通过性交把精液射入女性生殖道，男性生殖功能正常与否主要体现在精液质量上。在过去的五六年间，精液质量下降问题一直是医疗卫生界的重要议题之一，同时，人们已注意到环境因素可能是威胁男性生殖功能的元凶。虽然多年的讨论并没有对过去50年精液质量有否下降问题提供一个确定的答复，但是新的资料显示：生殖功能异常的机制是非常复杂的，可能受到诸多因素的影响，且精液质量似乎存在着地理差异和时间趋势。因此，不应该把精液质量作为一个孤立的现象来分析，而应该和病因学以及病理学的观点结合起来综合考虑，与男性生殖器官的病症（如尿道下裂、隐睾以及睾丸癌）结合起来分析。到目前为止，环境因素对这些病症的增加作用还不十分清楚。
近年来，虽然有不少研究指出全球性的精液质量、男性生育力在下降，但不同国家和地区所得结果不尽相同。迄今为止，我国尚无男性精液质量的正常值范围，只是借鉴国际标准。精液质量受到众多因素的影响，国际标准不一定适合我国国情。及时研究我国男性精液质量现状及环境影响因素，能为今后数十年的深入研究奠定基础，并为子孙后代留下可供比较的数据，对于提高民族素质和国家制定相关政策也具有重要意义。
1．2 国内外研究现状
1．2．1 精液质量的研究
精液质量是影响人类自身繁衍的一个要素。近几十年来，有不少研究指出精液质量在下降，但是结论不尽一致。首次报道人类精液质量可能存在下降的时间趋势是在20世纪70年代和80年代早期，由于这些资料主要来源于不孕症或选择性有生育力的男子，因而被认为存在选择偏倚，没有引起足够的重视。1992年美国Carlsen等人用Meta分析法研究了1938～1991年间发表的有关男子精液质量的61篇论文，指出精子密度均值由1940年的113×106／ml下降到1990年的66×106／ml。用直线回归模型计算出每年下降了0．93× 106／ml。用于分析的研究报告28份来自美国，17份来自西欧，7份来自亚洲，5份来自非洲，3份来自拉丁美洲，1份来自澳大利亚，因此认为精子计数的变化是一个全球现象。Carlsen的研究引起了很大的争议，首先主要集中在Meta分析中的精子资料是来自跨度长达50多年且是不同实验室的资料。随后的几个研究对Carlsen的Meta分析资料进行了再分析，有的肯定，有的部分反对。Swan等用直线和非直线模型作了细致的分析，控制了所有已知对精子密度有明显影响的混杂因素，如禁欲时间、年龄、被证实有生育力男性所占的百分比、样本采集方法、研究目的和地点等，发现在Carlsen收集的欧洲资料中平均精子计数从1971～1990年间有明显的下降。Bahadur，Becker和Berhane以及Swan等对Carlsen的资料中美国不同地域的精子密度进行了再分析，结论是一致的，即从1940～1990年间精子密度是明显下降的。对Carlsen等人研究的另一个争议点在于：Meta分析中的原始资料是来自全世界各地不同的人群和地点，来自精子计数方法不同的众多实验室。还有很多研究发现精液质量随时间是有下降趋势。英国的Irvine等对1951～1973年在苏格兰出生的577名志愿者进行的研究发现，后出生的人在精子密度、精子总数及活动精子数方面均低于先出生的人。Auger等研究了巴黎地区1973～1992年1 351个供精者的精液标本，发现精子密度以每年2．1%的速度明显降低，同时精子正常形态率和精子活动率也是降低的。Adamopoulos等报道1977～1993年间大雅典地区的2 385位男子的精液量和总精子计数也是降低的。
也有不少研究发现精液质量没有随时间下降趋势。芬兰的资料显示：20世纪90年代初收集的238个未知是否有生育力的正常健康男子的精液量、精子密度、总精子计数等数据和20世纪40年代的结果是相似的。Paulsen等对西雅图1972～1993年的14个临床研究中共510名健康、正常的男性志愿者精液质量进行了分析，发现过去的21年间男性精子密度、精液量、精子总数和精子正常形态率没有下降趋势。Bujan等分析了1977～1992年法国土伦地区252个供精者的样本，选择标准和Auger的研究相同，也未发现精子密度有和时间相关的变化。Rasmussen等对在1990～1996年期间进行试管婴儿治疗、出生于1950～1970年的1 055个丹麦男子的精液进行了回顾性分析，发现精子密度及精液量和出生年份没有关系，表明在过去20～25年间丹麦男性的精液质量没有变化。Fisch等对美国1970～1994年间做输精管结扎的1 283个男子的精液质量进行了分析，发现在过去25年间精液质量没有下降。Akre等对瑞典1983～1993年＞20岁的401 653个妇女进行了问卷调查，没有发现男性生育力降低。非欧洲地区如美国和以色列的研究也报道了精子计数没有变化，或甚至有升高的现象。
国内张树成等对1981～1996年16年间我国成年有生育力男性精液质量检测报告的114篇文献中涉及39个省市的共256份数据进行了综合分析。分析结果显示：精子计数由103．02×106／ml（1983）降至83．84× 106／ml（1996），精子活动率75．11%（1982）降至67．27%（1996），精子正常形态率由85．02%降至77．89%（1996），三者均与年份呈负相关，有统计学意义；排精总数由355．34×106／次（1984）降至262．26×106／次（1996），精液量由3．31ml（1981）降至2．97ml（1996），两者均呈下降趋势，但无统计学意义。分析结果提示：我国男性精液质量虽高于国外同期结果，但其下降速度却明显增加。
国内外对精液质量研究不同结论的可能由下列因素引起的：发表偏倚、不同的研究设计、不同的实验方法、不同对象选择标准、不同研究时期、不同的样本含量、存在地理差异及精液质量确实在下降。
1．2．2 环境污染及其可能影响精液质量因素的研究
有证据表明，目前不孕、不育率增加，自然流产率上升，儿童智力下降，睾丸癌和生殖系统肿瘤增加，新生儿尿道下裂、睾丸畸形、隐睾、阴茎过小等出生缺陷明显增加，以及性发育异常、障碍，性早熟，男性女性化等等也呈上升趋势。男性精液质量的降低与环境直接相关。科学家们已郑重警告环境污染与生物繁衍困难之间存在着必然的因果关系；造成的危害直接威胁到人类自身，也影响到其他生物。已有证据表明，某些化学物质是一些两栖类、鱼类、鸟类的种群退化及灭绝、生育力下降和丧失、雌性化等生物效应的元凶。
20世纪以来，各种电器的使用，使得“电子雾”充斥空间。临床医学报道，不孕症患者中计算机应用人员的比例偏高，他们认为电子雾敏感者睾丸内生精细胞严重异常。大环境的污染严重影响着精液质量。美国、日本的研究发现，二恶英、多氯联苯等使生育能力下降，女性乳腺癌升高；苯乙烯、双酚A、飘尘、皂酚等使精子发生畸形。化肥、农药、工业原料和食品添加剂的大量使用使环境受到了污染（特别是类雌激素样物质），如滴滴涕、五氯酚和六六六等都会对精液质量产生严重影响；环境中的铅、锰、镉、汞、砷、氟、氯等元素及二硫化碳等化合物也对接触工人的精液质量产生不良影响，并有可能污染环境，使得一般人群的精液质量也受到损害。
此外，人们的行为因素，包括使用兴奋剂，如吸烟、酗酒、使用麻醉剂及药物等；暴露于可升高阴囊温度的环境，如蒸汽浴，坐着工作（如司机等）、着紧身内衣和纵欲等也影响精液质量。精神紧张也被认为与精液质量有关。饮食也与精液质量有关，食品及营养品中存在类雌激素样物质，一些地区的大米中含镉量较高，饮水中存在微量元素氟、锌、碘等均不同程度地影响着精液质量。
1．2．3 不育研究
据WHO报道，全球有8%～12%夫妇在生命的某一时刻存在不孕；在发展中国家不孕为首位的妇科会诊原因。WHO的一项多中心研究发现：不育夫妇中男性是不育的唯一原因或因素之一超过50%。PATH报道：不育夫妇中，单纯女方因素占25%～37%，单纯男性因素占8%～22%，男女双方因素占21%～38%。男性不育率的增高和精液质量的下降是密切相关的。因此，研究人群中溶脲脲原体（ureaplasma urealyticum，UU）和沙眼衣原体（chlamydia trachomatis，CT）感染与精液质量的关系，对于预防性传播性疾病（STDs）和提高不育、不孕的诊疗水平，以及提高我国人口素质等具有重要的理论意义和实用价值，更有深远的社会意义。
1．2．4 精子发生的基因研究
环境内分泌干扰物（EDDs）可明显减少精子的生成，EDDs导致精子数量下降及畸形精子数量增加的一个重要因素是遗传性状的改变。Y染色体上（Yq11，23）存在着调控精子发生的基因，称为无精子因子（azoospermia，AZF），AZF的缺失或突变可导致无精子或严重少精子，引起不育。无精子或严重少精子症患者中存在YRRM基因缺失，YRRM基因是AZF的重要候选成分，DYS1和DYS200基因中任何一位点缺失均可导致精子发生障碍，DAZ基因可能在精子发生的第一阶段或更早期起作用，精子mtDNA缺陷与精子活力及男性不育间是否相关引起人们的关注。
1．3 前期科研和工作基础
研究单位之一的国家计划生育委员会科学技术研究所分析了1981～1996年16年间我国成年有生育力男性精液质量检测报告文献114篇，涉及39个省市的9 292人、11 726人次样本，共256份数据。分析结果显示：精子计数由103．02×106／ml（1983）降至83．84×106／ml（1996），精子活动率由75．11%（1983）降至67．27%（1996），精子正常形态率由85．02%（1983）降至77．89%（1996），三者均呈统计学显著性负相关（P＜0．05）；排精总数由355．34×106／次（1984）降至262．26×106／次（1996），精液量由3．31ml（1981）降至2．97ml（1996），两者均呈下降趋势，但无统计学意义（P＞0．05）。
1998年12月～1999年1月上海市计划生育科学研究所组织了全国7个省市（上海、浙江、河南、河北、山西、贵州和山东）开展了年轻男性精液质量的评估及影响因素研究的预初试验，共接纳了732例年龄在20～30岁的男性婚检对象，结果如下：①精液量为2．54±1．45ml，精子密度为63．13±35．39×106／ml，快速前向运动的精子所占百分比为29．96±21．46%，正常形态精子的百分比为74．48%±10．15%。卵泡刺激素（FSH）值为4．50±2．11IU／ml，黄体生成素（LH）值为4．50±3．13IU／ml，雌二醇（E2）值为46．15±16．58IU／ml，睾酮（T）值为11．07±4．43IU／ml。②逐步回归分析表明：可能影响精子活动率的因素有精索静脉曲张、家中使用取暖器、家中电器数量、14～15岁时的居住地、性生活史、遗精史、手淫史及房子装修情况等。可能影响精子形态的因素有5岁前居住地、上下班使用的交通工具、身高、遗精史、接触农药以及卵胞刺激素水平。可能影响精液量的因素有咖啡、雌二醇摄入等。血中锰、镉及铅也与精液质量有关。另外，可能由于预初试验是在市区和市郊，没有发现农村和城市男性在精液质量和激素水平方面有明显差别。
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2．项目的研究目的、内容和方案、地点、设备选型
2．1 本项目的研究目的
（1）总目的：了解全国健康男性精液质量的状况，以及可能影响精液质量的主要因素，根据研究结果，提出预防环境有害因素对男性生殖影响的对策和环保建议。
（2）具体目的
1）了解全国不同年龄段、居住地、职业等不同人口学特征男性精液质量的状况，建立一个参照值范围。
2）了解男性生殖激素水平［卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、睾酮（T）］、微量元素（锌、铜、锰、铅、镉）与精液质量的关联程度。
3）了解行为因素（吸烟、饮酒等）、精神因素、生活习惯、生活环境、生长发育状况、环境因素等对精液质量的可能影响。
4）了解特殊人群（生殖道感染、电子视屏作业、接触农药等）的精液质量状况，研究这些职业接触因素对精液质量的影响。
5）对部分特殊人群的染色体进行DNA含量倍体分析，测定精液中凋亡精子、单倍体精子、二倍体精细胞、四倍体精细胞等的数量和比例，同时也分析精液中精子的成熟状况，了解某些环境因素对精子可能的作用机制。
2．2 项目研究的内容
项目研究的内容有以下两大部分：
（1）对一般正常男性的精液质量进行评估及其影响因素研究，在全国的六个研究中心（河北、贵州、浙江、山西、山东和河南）进行，共收集1 200例研究对象。各研究中心负责收集200例，城市与农村人群各100例，要求在20～29岁，30～39岁，40～49岁，50～59岁四个年龄段各选取健康男性25例。
（2）研究特殊人群（生殖道感染、电子视频作业、接触农药等）的精液质量及影响因素，对部分特殊人群的染色体进行DNA含量分析，同时也分析精液中精子的成熟状况。本研究共需调查2 400例，其中一般人群1 200例（农村600例，城市600例），特殊人群1 200例（生殖道UU阳性者200例，对照200例；电子视频作业200例，对照200例；接触农药者200例，对照200例），对农药接触者200例及对照200例。对这些人群的精液质量进行分子流行病学研究（附图1－1）。
附图1－1 样本含量
2．2．1 正常男性精液质量评估及影响因素研究
2．2．1．1 研究内容
（1）问卷调查：除一般人口学特征外，还包括男性的性功能状况：性欲、性生活频度、阴茎勃起、性交、射精、性欲高潮、手淫史及生育史等；化肥、农药接触史；吸烟、酗酒、使用麻醉品情况；是否暴露于能升高阴囊温度的环境因素，如蒸汽浴、坐着工作、穿着紧身裤、使用电热毯以及精神紧张等。另外，还包括出生时父母的职业、父母的有害毒物接触史等。
（2）体格检查及外生殖器检查：对研究对象作常规的体格检查和外生殖器（阴囊、阴茎、睾丸、附睾等）的检查及测量。
（3）当地环境污染状况的定量描述
1）本研究的重点是：建立当前的中国精液质量的参照值范围，以及在当前环境条件下的男性精液质量的现状，并可为今后男性精液质量改变的研究提供有用信息：
a．各省市精液质量和环境质量分别与历史资料进行比较，以发现精液质量和环境质量与年份（时间）的关系。
b．提出精液与环境变化的研究假设。本研究是横断面调查，了解各研究现场的环境状况，分析过去这些研究现场的环境质量和精液质量可能的联系。
在此横断面研究中，将加入生活环境中有害因素及部分职业危害因素的接触史及暴露程度的调查，以了解精液质量是否与某些因素有关，为进一步的研究提供信息及假设。
2）环境污染的评价方法：在测定各研究现场的有代表性的精液质量外，可以结合测量此研究现场的目前主要大气污染物：主要污染源的种类（氮氧化物、二氧化硫、总悬浮颗粒物等）、地理分布、污染程度以及排放的年限（10年内）。
（4）精液质量的测定及方法：对研究对象作二次精液检查（两次间隔7～30天）；每次需禁欲3～6天，手淫法射精的精液量、黏稠度、液化时间、精液酸碱度、精子密度、精子活动力、精子存活力、精子畸形率、非精子细胞等。按照WHO推荐的标准方法检测。
（5）血中微量元素及激素水平的测定：采用原子吸收分光光度计测定调查对象血清铅、锰、镉、铜及锌含量；采用放射免疫法测定血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）及睾酮（T）的浓度。
2．2．1．2 研究对象及样本量
（1）样本量：对一般人群的精液质量平均数作抽样调查时的样本含量估计。根据不同的精液指标进行样本含量估计，会得出不同的样本含量估计值。精子密度的变异度居中，而且具有较好的代表性，故在样本含量估计时，可以采用之。根据预实验结果：精子密度：MEAN＝63；SD＝35；N＝（Uασ／δ）2＝（1．96×35／5）2＝188例。6个地区：188×6＝1 128人。考虑到设计因素：样本量定为1 200人，即每地区200人。
（2）研究对象：研究对象为年龄20～59岁正常男性志愿者居民。本课题计划在全国6个省（市）进行。在每个省（市），抽取一个城市及农村（含郊区）地区。考虑到不同年龄的人群对环境暴露不同，生理特征亦不同，因而将研究对象分四个年龄组。
1）制定分组原则如下：
城市：100人：20～29 30～39 40～49 50～59 各25人。
乡村：100人：20～29 30～39 40～49 50～59 各25人。
2）研究对象接纳标准：①年龄20～59岁；②愿意接受调查并禁欲3～6天提供2份精液标本（两次间隔7～30天）；③愿意提供血液样本。
3）研究对象排除标准：①有泌尿、生殖器疾患史者；②有结核病史者；③目前有糖尿病、肾脏、心脑血管病等严重全身性慢性疾病；④调查前3个月内患有严重的急性疾病；⑤精索静脉曲张Ⅱ度及以上；⑥最近一年内从事高温作业；⑦最近一年内从事接触苯、二溴氯丙烷、二溴乙烯等有机溶剂的作业；⑧最近一年内从事接触杀虫剂、除莠剂等有机农药的作业；⑨最近一年内从事铅接触、焊接作业。
（3）伦理道德方面：本研究承诺研究对象所提供的所有信息不以涉及个体的方式在任何媒体发表，且不涉及个人姓名。尊重个人拒绝参加本研究的权利。
对研究对象不造成任何伤害。
2．2．2 特殊人群的精液质量研究
选择三个特殊人群（生殖道感染、电子视频作业、接触农药等）研究其精液质量及影响因素，对部分特殊人群的染色体进行DNA含量分析，同时也分析精液中精子的成熟状况。
2．2．2．1 生殖道溶脲脲原体与精液质量
（1）研究背景及其意义：环境因素（尤其是感染因素）对生殖健康的影响已愈加引起人们的重视。其中以溶脲脲原体（ureaplasma urealyticum，UU）感染面最广，并且呈迅猛增长趋势。根据世界卫生组织（WHO）近年来的报告，由UU感染引起的非淋球菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU）发病率占各种性传播疾病的首位。据统计，美国每年有250万～400万例UU所致生殖道感染。在美国波士顿公立医院，临床病人中的UU分离率为76．3%。美国已将供精者的精液UU筛查作为人工授精（包括IVF－ET，ICSI等）的必须检查项目。根据上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）对1 416例不明原因不育男性的精液培养结果表明，UU分离率为38．77%。该研究还在国内外首次证实，UU可吸附在生精细胞和精子表面，甚至侵入生精细胞内，造成精子和生精细胞的破坏。对1 021例孕妇进行宫颈黏液UU检测，发现感染组较对照组宫内窘迫和胎膜早破明显增高（p＜0．05）。但迄今为止有关UU对精液质量的影响尚缺乏严格而系统的研究。
因此，研究UU对生殖健康的影响，尤其是其对精液质量的影响，无疑既有重要的理论意义，又有广泛的临床应用价值；既有重大深远的社会影响，又有显而易见的经济效益。
（2）研究目的
1）了解人群中UU的感染情况；
2）了解UU感染者精液质量情况；
3）探讨UU感染与精液质量的联系；
4）根据研究结果，提出进一步的研究假设。
（3）与本研究相关的文献回顾：有文献报道涉及UU与精子发生和精液质量的关系。有人从不育男性睾丸活检标本上分离出了UU，提出UU可能干扰精子的发生过程［1］。对625例不明原因不育男性的精液标本检测发现，其中246人（占39%）UU阳性，伴有精子形态学异常和精子活力下降［2］。上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）用UU人工感染大鼠，发现部分动物生精小管出现大量多核巨噬细胞，生精细胞严重脱落。电镜观察发现：UU吸附或者侵入生精细胞内，造成生精细胞胞质空泡化或崩解［3］。该研究还在国内外首次证实，UU可吸附在生精细胞和精子表面［4］。国内外均有报道：精液UU培养阳性的不育患者，精子的畸形率明显增高，主要是卷尾畸形［3，5，6］。研究发现：UU感染的不育男性精子或用UU体外感染的精子，运动力均下降［7，8］。可能的原因有：UU吸附在精子的头部、中段和尾部，使精子由流线型变得“臃肿”，使精子前进时的流体动力学阻力增大，影响精子的运动速度；卷尾畸形使得精子靠尾部有力地摆动所产生的向前推进作用力明显减弱，而这种有力的尾部运动正是精子受精的先决条件之一［9］。
由此可见，UU对精子发生以及精子质量产生不良影响的可能性是存在的。
（4）研究内容：门诊随机选择生殖道UU阳性者200例，选择200例年龄、职业相近的生殖道UU检查阴性者作为对照，完成对象的两次精液采集以及静脉血标本采集。
对收集到的精液进行各种参数分析，静脉血标本送交上海市计划生育研究所统一测定血中内分泌激素。
（5）研究方法
1）研究设计：本研究采用现况调查（prevalence survey）或称横断面研究（cross－sectional study）。在上海城市地区现场取材，以问卷询问结合精液质量测定，评估UU感染与精液质量的关系。问卷调查加强对感染病史、卫生习惯的询问，实验室进行有关感染的检查。
2）研究现场：在上海城市地区，选择2～3个有研究经验的医院门诊部为研究现场。
3）研究对象接纳标准：①年龄20～44岁的男性（要求对照年龄与试验对象的年龄上下不超过2岁）；②愿意接受调查并禁欲3～6天提供2份精液标本（两次间隔7～30天）；③愿意提供血液样本。
4）研究对象排除标准：①有泌尿、生殖器疾患史者（研究因素除外）；②有结核病史者；③目前有糖尿病、肾脏、心脑血管病等严重全身性慢性疾病；④调查前3个月内患有严重的急性疾病；⑤精索静脉曲张Ⅱ度及以上；⑥最近一年内从事高温作业；⑦最近一年内从事接触苯、二溴氯丙烷、二溴乙烯等有机溶剂的作业；⑧最近一年内从事接触杀虫剂、除莠剂等有机农药的作业；⑨最近一年内从事铅接触、焊接作业。
5）研究样本：据中国婚检男性精液质量分析及影响因素研究（未发表，上海市人口与计划生育委员会局管基金）报道，婚检人群正常形态精子占精子总数的75%左右。假设UU生殖道感染致使病理性外观的精子比例增加了85%，即相对危险性（RR）＝1．85，α＝0．05，β＝0．20，经计算n＝176人／每组，在理论样本量的基础上增加10%的样本量，则本研究所需的样本量为每组200人。检出UU阳性者为试验组，UU阴性者为对照组。
6）观察指标
a．问卷调查：了解既往病史（包括生殖道感染史）、职业、嗜好等。
b．体格检查：一般体检、外生殖器检查。
c．精液收集与检测，特别注重UU的检测。
d．血液采集测定内分泌激素水平。
7）质量控制：①统一培训现场调查人员；②按研究设计选择研究对象；③统一进行现场的体格检查、精液收集与检测、血液采集与检测。
8）数据分析：研究所获信息按资料的性质，以计量资料和计数资料的相应统计分析方法，进行单因素和多因素分析。
9）研究进度：同总课题设计的执行期限和进度安排。
（6）伦理道德方面：本研究承诺研究对象提供的所有信息不以涉及个体的方式在任何媒体发表，且不涉及个人姓名。尊重个人拒绝参加本研究的权利。
对研究对象不造成任何伤害。
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2．2．2．2 电子视屏作业与精液质量（回顾性队列研究）
（1）研究背景和意义：1992年有关全球性精子密度下降的报道发表，此报道因对人类社会生存和发展极为重要而受到高度重视，争论随即在各杂志涌现。Pusch［1］认为，在过去的50年间每次射精的平均精子数下降一半。Parazzini等［2］认为，过去20年内不同人群中出现精子计数下降，可部分归因于研究对象选择不妥和数据分析不全或方法错误，且这种下降与过去25年间男性不育率持续稳定相左。即便不育症求医者增加，也可能是由于晚育的趋势所至或治疗可获得性的上升。Parazzini的研究表明：精液并非总是男性生育力的决定因素。Swan等［3］对61项研究结果进行再次分析评估，在控制了禁欲时间、年龄、生育力、精液采集方法、研究目标和研究场所后，发现平均精子密度欧洲最高，美国其次，非西方国家最低。精子密度下降仅在欧洲（1971～1990）和美国（1938～1988）有统计学意义，未发现非西方国家（1978～1989）出现精子密度下降。Swan的研究提示平均精子密度的地区差别，受多种因素影响，如人种、气候、饮食等，由此揭示有关中国的精液质量研究不能完全采用欧美的研究标准、不能完全沿用欧美的研究结果。同时，Swan对非西方国家的研究仅覆盖1978～1989年的数据，可能不足以揭示非西方国家同样存在精子密度下降的真实情况。至今，有关中国精子密度和质量的权威数据尚未见有在国际学术期刊上发表。
精液质量与男性生育力的密切程度是毋庸置疑的。同时，精液质量的改变，如同女性自然流产，是环境危害累及男性生殖功能的敏感评估指标。有关电子视屏与精液质量关系的研究屈指可数。Fracki［4］发现在以电脑为专业工作的不育症者中，精液中病理性外观精子的增加幅度与从事电脑工作的年限呈统计学意义的正相关。至今为止，相关报道并不多见，我国在该领域的研究呈空白状态。
随着科技进步和计算机产业化和网络化的快速发展，接触电子视屏的人数持续不断增加，难以计数。同时，处于生殖系统快速生长发育期的广大青少年，对接受多媒体教育和操纵电子游戏热情不减，促使提出对电子视屏与精液质量关系的研究。
（2）研究目的
1）了解电子视屏作业者精液质量的现况，包括精子密度、精子计数、精子形态、精子前向运动等指标。
2）比较是否电子视屏作业者间的精液质量的状况，包括精子密度、精子计数、精子形态、精子前向运动等指标。
3）探讨精液质量与各影响因素间的联系及强度，主要着重在电子视屏作业与精液质量关系的评估。
4）根据研究结果，提出进一步的研究假设。
（3）与本研究相关的文献阅读：研究精液质量，是为了最终保护男性生殖功能健康并维持正常生育力。电子视屏作业对生殖健康的影响包括是否与受孕时间延长、子代出生异常，包括出生性比例异常和生长发育异常有关。Pontonnier等［5］认为，造成男性不育的原因可分为四类：①因性腺发育缺乏、先天发育异常、精索静脉曲张所致的睾丸异常，或先天／后天自身免疫所致的睾丸异常，进而导致精子异常；②因精液感染、自身免疫、同种免疫所致的精浆异常；③因病理性／医源性逆性射精、器质性／心理性射精不能所致的射精异常；④原因未明。因受研究资源的限制，如研究经费、研究周期、研究信息的完整性和研究样本的可获得性，本研究从探讨电子视屏作业与精液质量的关系入手，均衡其他影响因素（流行病学研究中的混杂因素）对精液质量的作用，研究环境改变／职业接触与精液质量的关联及强度。
如同绝大多数疾病的病因学研究显示：精液质量下降，包括精子密度下降、精子计数减少、精子形态异常、前向运动减弱等，为多因素作用所致的异常。据文献报道，精索静脉曲张［6］、隐睾［7］、阴囊温度过高［7］、高温工作［8，9，10，11］、生殖器感染［6］、X射线［6，10，12］、紫外线［12］、电磁场［12，13］、苯［6］、二溴氯丙烷［10，11］、二溴乙烯［10］、杀虫剂［6，14，15］、除莠剂［11］、重金属／铅［10，14，15］、焊接／不锈钢焊接［10，16，17］、外源性雌激素［15］、汽车司机工作［18，19］，与精子活力缺乏、精子畸形、精子数量缺乏、受孕能力降低的发生相关联。此外，年龄［20，21，22］、种族［23］、生活习惯如吸烟［24，25，26］、饮酒［27］、季节变化［28，29］，以及出生时父亲年龄和健康状况［25］也可影响精液质量。与此相对，肉毒碱、精氨酸、锌、硒、维生素B12、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、辅酶Q10、针灸［15］及某些草药被认为可提高精液质量。
由于精液质量改变是多因素共同／协同作用的结果，因采用不同的研究人群、研究设计、研究样本、分析指标而获得不一致的研究结果实属正常。如Adelusi等［31］认为吸烟和咖啡摄入对生育力降低的沙特阿拉伯男性有提高精子前向活动能力的作用。Vine等［32］未发现在健康志愿者中吸烟、饮酒和咖啡摄入累及精子细胞核的形态学和染色体改变。电磁场作业［33］和金属焊接作业［34，35］与精液质量下降的关联也有否定的报道。并且，由于出版偏移的存在，各种持否定观点或获得阴性结果的研究远超过报道数。
Fracki等［4］对专业计算机操作与生育力关系进行研究。1986～1991年间在波兰，2 376例确诊不育的男性中20例（0．84%）为年龄在26～40岁的专业计算机操作者，每天使用计算机不少于5小时，工作年限在2～12年间。在对精子密度、精子活动度和精子形态学进行分析时发现，精子活动度全面下降，而精子密度下降和精子活动度下降与计算机显示屏暴露年限的相关性不具统计学意义，但病理性形态的精子所占的百分比与工作年限呈正相关并具统计学意义。Fracki的研究对象为不育男性，即系列病例调查（case series），难以阐述研究对象的各种特征与已成事实的生育力下降的关联和强度，难以判断生育力下降与电子视屏作业的时间顺序，难以控制其他影响精液质量的因素的作用（包括相互作用），以及这些其他因素的作用是否也存在于生育力正常的男性中。Fracki等发现病理性形态的精子所占的百分比与工作年限呈正相关仍具统计学意义，提示需对电子视屏作用与精液质量的关系作进一步研究。
（4）研究方法
1）研究设计：电子视屏作业与精液质量降低之间的关系评估，一般可采用现况调查比较一般人群中电子视屏作业与精液质量的联系强度、病例（生育力降低）－对照（生育力正常）研究比较两组间既往电子视屏作业的频率差和相互联系强度、回顾性或前瞻性队列研究比较电子视屏作业组与非电子视屏作业组间出现精子质量下降的频数差和相互联系强度，这些研究设计各具优点和不足。因伦理道德和其他限制目前不宜运用因果关系逻辑推论充分的随机试验。经综合考虑，本研究采用回顾性队列调查，在接触电子视屏比较多的上海、北京等城市现场选取，同时段（季节）建立具既往电子视屏作业史的试验组和非既往电子视屏作业史的对照组，以问卷询问结合精液质量测定，评估电子视屏作业与精液质量的关联。
2）研究现场：在上海、北京等电子视屏接触较多的城市地区作为研究现场。
3）研究对象接纳标准：①年龄20～44岁男性；②愿意接受调查并禁欲3～6天提供精液样本（两次间隔7～30天）；③愿意提供血液样本；④明确的电子视屏操作史。
研究组：目前从事电子视屏作业满24个月，每个工作日接触电子视屏大于5个小时。
对照组：最近两年内接触电子视屏每天不得大于2个小时。
4）研究对象排除标准：①有泌尿、生殖器疾患史者；②有结核病史者；③目前有糖尿病、肾脏、心脑血管病等严重全身性慢性疾病；④调查前3个月内患有严重的急性疾病；⑤精索静脉曲张Ⅱ度及以上；⑥最近一年内从事高温作业；⑦最近一年内从事接触苯、二溴氯丙烷、二溴乙烯等有机溶剂的作业；⑧最近一年内从事接触杀虫剂、除莠剂等有机农药的作业；⑨最近一年内从事铅接触、焊接作业。
5）研究内容及观测指标：征得研究对象同意，完成研究参加志愿表填写，通过筛选表，进行主询问表调查，完成体格检查、精液采集（或预约采精日期）、血样采集。
a．问卷调查：在总课题研究设计的问卷基础上，强化对既往电子视屏作业（对照组为某特定职业）的问讯，包括起始工作的时间、工作年限、每日工作时间、工作岗位或职业改变、生育意愿、首次遗精年龄、出生体重（是否低体重）、出生孕期（是否早产）、出生时父母年龄、咖啡摄入、既往疾病、生殖器感染、隐睾等项目。
b．体格检查：在总课题研究设计的体格检查及外生殖器检查的基础上，增加检查前列腺的项目。
c．精液收集和质量测定：同总课题研究设计精液采集和测定方法，一次精液采集。
d．血中激素水平测定：同总课题研究设计的测定方法。
6）研究样本：据中国婚检男性精液质量分析及影响因素研究（未发表，上海市人口与计划生育委员会局管基金）报道，婚检人群正常形态精子占精子总数的75%左右。假设电子视屏作业致使病理性外观的精子比例增加了85%，即相对危险性（RR）＝1．85，α＝0．05，β＝0．20，经计算n＝176人／每组，在理论样本量的基础上增加10%的样本量，则本研究所需的样本量为每组200人。
7）质量控制
a．统一培训现场调查人员。
b．按研究设计选取研究对象。
c．统一各现场的队列建立时段。
d．统一各现场的体格检查、精液收集和质量测定、血中微量元素及激素水平测定的方法。
8）数据分析：研究所获信息按资料的性质，以计量资料和计数资料的相应统计分析方法，进行单因素和多元分析。在控制可能的混杂（confounders）后，研究电子视屏作业（risk factors）和其他影响因素（determinants）与精液质量的联系及其强度。
9）研究进度：同总课题研究设计的执行期限和进度安排。
10）不足之处：本研究采用回顾性队列研究的方法，在建立研究组时可能会部分遗漏曾从事电子视屏作业并因其后发生精液质量下降而改变职业的潜在研究对象（response rate of eligible subjects），即累及资料的完整性。同时，也可因各种原因（如健康工人效应、无生育意愿）降低或增加具精液质量降低的潜在研究对象。
（5）伦理道德、获益和可能的危险：因个人生活方式、家庭情况、精液、血液的私密性，本研究允诺研究对象所提供的各类信息不以涉及个体的方式在任何媒体发表、不涉及个人姓名。尊重个人拒绝参加本研究的权利、尊重个人获得医疗健康服务和其他合法权利。
通过本研究的实施，可增加人类社会对提高和保护精液质量的了解，可提供初婚夫妇接受生殖健康教育的机会，可提高被怀疑为（确证为）精液质量下降的男性及时治疗的获得性。
对研究对象不造成任何伤害。
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2．2．2．3 农药接触与精液质量
（1）研究背景及其意义：有研究报道：在实验条件下，许多农药能显著改变雄性动物的生殖能力。类雌激素样作用的农药对雄性动物的生殖参数均有显著的影响。动物急性试验表明：各种农药对雄性生殖功能具有显著的影响。主要体现在：输精管上皮细胞的损伤，睾丸质地增加，生精小管退化变形，并伴有精子和生精细胞数量的减少。人群研究表明：正常人群精液中可检测到六氯环己烷（其γ型异构体是有效的杀昆虫药）及其同分异构体、有机氯农药DDT及代谢DDE和DDD［1］。加拿大Arbuckle等收集97位研究前使用过2，4－D（苯氧羧酸类除草剂）农民的精液，发现50%精液中可检测到2，4－D（≥5．0ug／ml），既然精液中可出现这些农药成分，就有可能对精子的生成产生毒作用，甚至可影响胚胎发育［2］。在对男性生殖功能的影响方面，由于农药的种类、接触方式、接触时间、接触剂量等方面存在很大的差异，研究结果也不尽一致。而且，到目前为止，尚未有慢性接触农药对男性生殖功能的影响的大规模流行病学的报道。本研究拟采用回顾性队列调查的方法，研究长期（≥5年）接触农药对处于生育功能较强阶段的男性精液质量的影响。
（2）研究目的
1）了解农药接触者精液质量现况；
2）探讨接触农药与精液质量的联系及确定是否存在剂量反应关系；
3）探讨其他影响精液质量的相关因素；
4）根据研究结果，提出进一步的研究假设。
（3）与本研究相关的文献回顾：Padungtod等对中国杀虫剂男工和纺织男工的精液质量进行了比较，两组精液质量有关参数的中位数分别为：禁欲时间为3天（4天），精子密度为52．8×106／ml（53．1×106／ml），正常精子活动力为50．5%（61．3%），精子正常形态率为59%（61．5%），结论是中等程度的有机磷杀虫剂职业暴露能增加精子非整倍体的发生率［3］。
Donat等对生产有机汞类除草剂和卤代烃类杀虫剂的工人精液质量进行研究，工作地点空气中除草剂、杀虫剂浓度与男性生殖力有关，浓度越高，生殖力下降越厉害，尤其在杀虫剂浓度超过最高允许浓度时［4］。
Juhler和Larsen对饮食接触农药者（即农作物、蔬菜等残留农药问题）精液质量进行研究，将研究对象分为三组：50%～100%均为使用自然肥料培育出的食物；1%～49%为自然肥料培育出食物；0%为自然肥料培育出的食物。结果发现三组精液质量并无统计学显著性差异，但没有使用自然肥料培育作物者，正常形态精子所占百分比低于其他两组。各种不同的农药对精液的影响主要表现在精子密度、死精子所占的百分比、具正常头部精子所占百分比、精子运动能力方面。五种农药（azinphos－methyl，carbaryl胺甲萘，chlorfenson，fenitrothion和tetradifon）与死精子所占的百分比有关［5］。
Larsen等比较了丹麦使用杀虫剂和不使用杀虫剂农场主的待孕时间，回顾性研究未发现杀虫剂对丹麦农场主的男性生育力有任何影响，他们发现精子形态、活动力、存活率、精子染色质变性、生殖激素在暴露于杀虫剂组和未暴露组间仅有微小差别，且没有统计学意义，结论是丹麦农场主使用杀虫剂在短期内对精液质量和生殖激素没有作用［6，7］。
Tomenson等研究了生产除草剂（氨基硫氰酸酯）工人的精液质量，他们在四次高低浓度（12．7mg／m3～210．9mg／m3）交替暴露后，采集精液，结果提示该除草剂暴露与精子质量及血清激素并无直接联系［8］。
（4）研究内容
本研究宜选择从事农药接触工作如蔬菜种植至少5年，每天至少使用1小时，每年共有7次农药接触者，年龄＜45岁的男性200人作为研究对象，对照200人，完成对象的两次精液采集以及静脉血标本采集。
对收集到的精液进行各种参数分析，静脉血标本送交上海市计划生育研究所统一进行激素和微量元素的测定。
（5）研究方法
1）研究设计：本研究采用回顾性队列调查的方法，详细调查研究对象的农药接触史，结合精液质量测定，评估农药接触与精液质量的关系。
2）研究现场：在北京、上海有农药接触机会的地区选择2～3个郊区进行调查。
3）研究对象：近5年有农药接触史（每天接触1小时以上，每年累计在7天以上）为试验组，无农药接触与使用史为对照组。
4）研究对象接纳标准：①年龄20～44岁男性；②愿意接受调查并禁欲3～6天提供精液样本（两次间隔7～30天）；③愿意提供血液样本。
5）研究对象排除标准：①有泌尿、生殖器疾患史者；②有结核病史者；③目前有糖尿病、肾脏、心脑血管病等严重全身性慢性疾病；④调查前3个月内患有严重的急性疾病；⑤精索静脉曲张Ⅱ度及以上；⑥最近一年内从事高温作业；⑦最近一年内从事接触苯、二溴氯丙烷、二溴乙烯等有机溶剂的作业；⑧最近一年内从事接触杀虫剂、除莠剂等有机农药的作业；⑨最近一年内从事铅接触、焊接作业。
6）观察指标：
a．问卷调查：在一般问卷的基础上，针对性的调查该对象的农药接触史，包括每次接触农药时间、农药接触的频度、农药接触量、农药种类、作业时防护措施、生活习惯，尤其是吸烟史。
b．体格检查：一般体检、外生殖器检查。
c．精液收集与检测。
d．血液采集测定内分泌激素和微量元素。
7）研究样本：据中国婚检男性精液质量分析及影响因素研究（未发表，上海市人口与计划生育委员会局管基金）报道，婚检人群正常形态精子占精子总数的75%左右。假设接触农药致使病理性外观的精子比例增加了将近70%，即相对危险性（RR）＝1．70，α＝0．05，β＝0．20，经计算n＝190人／每组，在理论样本量的基础上增加10%的样本量，则本研究所需的样本量为每组200人。
8）质量控制：
a．统一培训现场调查人员；
b．按研究设计选择研究对象；
c．统一进行现场的体格检查、精液收集与检测、血液采集与检测。
9）数据分析：研究所获信息按资料的性质，以计量资料和计数资料的相应统计分析方法，进行单因素和多因素分析。
10）研究进度：同总课题设计的执行期限和进度安排。
（6）伦理道德方面：本研究承诺研究对象所提供的所有信息不以涉及个体的方式在任何媒体发表，且不涉及个人姓名。尊重个人拒绝参加本研究的权利。
对研究对象不造成任何伤害。
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2．2．3 精液质量的分子流行病学调查
2．2．3．1 立项依据及国内外研究现状
（1）环境因素与精子质量的关系的研究：国内外研究表明，多种环境污染因素可能影响精液质量（包括物理因素、化学因素、生物因素等）。
1）化学因素：在诸多的污染物中约有70%以上与环境内分泌干扰物（EEDs）有直接关系，它对人类、家禽、野生动物健康与繁衍的不良影响已成为全球普遍关注的热点。EEDs主要包括多氯联苯（PCBs）、二恶英（TCDD）和多溴联苯（PBBs），它们可通过职业性和生活性接触，经食物链或生物链进入人体。这些成分通过雌激素样作用、拮抗雄激素受体、干扰内源性甾体激素及其受体的合成代谢等机制，对人类的生殖能力造成严重的威胁。
有研究表明，EEDs可明显减少精子的生成，导致可逆性或永久性的生育障碍：EEDs导致精子数量下降及畸形精子增加的因素有多种，其中遗传性状的改变是一个重要方面。
此外，许多化学因素是人类生产、生活中常接触的，如食品添加剂、色素、亚硝基化合物等具有致癌作用，其代谢产物可通过血睾屏障作用于睾丸，使生精细胞、间质细胞的功能受到影响进而发生病变。多种重金属元素如铅、镉、汞、砷等使精子畸变，抑制精子发生过程。而微量元素锌、硒、铜等缺乏也可直接或间接的通过影响脑垂体的功能、促性腺激素的释放及影响与精子发生和活动有关的酶类的活性，从而影响睾丸的生精过程和精子质量。化学物质苯乙烯、皂酚等可引起精子畸形。多种药物也对生育能力有影响，环磷酰胺能使睾丸生精功能障碍，苯丙氨等一些中枢神经系统兴奋剂能影响神经递质的合成释放、受体的激活等，以致使丘脑－垂体－睾丸性腺轴的功能状态改变，从而影响生精功能。此外长期吸烟，由于尼古丁的有害作用可使精子数减少，酒精中毒也会使精子质量受到损害。
2）物理因素：各种电离辐射如X射线、γ射线及“电子雾”等对男性生育能力有着多方面的影响，它们可使睾丸间质细胞产生性激素受抑制，使生精细胞染色体发生突变，引起流产和致畸，还能够损害精子的发生，使精子质量降低。微波、高温等非电离辐射也可引起精子发生障碍。有报道认为阴囊环境温度过高如蒸汽浴、穿紧身裤等对生育能力有不良影响。高温作业的工作人员因受热辐射作用生育能力低于正常人。
3）生物因素：男性生育能力及精子的质量受到多种病原微生物、寄生虫的影响。它们可致睾丸炎、附睾炎、精囊炎和前列腺炎、非淋球菌尿道炎从而引起不育不孕。研究表明解脲支原体（UU）是引起男性不育症的重要原因。UU可吸附于精子表面，减慢精子的运动速度，同时吸附于精子顶体的UU阻碍精卵识别与融合。UU还造成精子畸形增多，如小头、颈部肿胀、卷尾等，UU的代谢产物对精子具有毒害作用，可破坏精子膜的完整性。此外，UU还可侵入生精细胞中，造成生精细胞结构破坏而从曲精小管上脱落。UU感染还与生精细胞凋亡有关。由于UU感染引起精子畸形染色体异常等可能是流产、致畸、死胎的重要原因。
沙眼衣原体（CT）在睾丸炎、前列腺炎、非淋球菌性尿道炎患者中的检出率，显著高于正常人。而睾丸炎等可影响精子的发生，引起精子畸形、染色体异常等可能导致流产、致畸、死胎等的发生。CT感染使男性抗精抗体明显增高，精子质量降低。肺炎支原体（MP）在男性不育病人中感染率高，MP会黏附于精子上使精子运动异常，损坏精子细胞。有报道弓形虫侵入睾丸生精细胞寄生、增殖，致生精细胞分裂障碍和坏死，干扰睾丸功能，使生精能力低下，引起男性不育，弓形虫也是引起流产、致畸、死胎的重要原因之一。但是否可通过性传播尚无定论。
此外，淋球菌、结核杆菌、滴虫、白色念珠菌及一些金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的L型菌株感染，可导致睾丸功能下降、精子数目减少、畸形精子增多、精子寿命缩短、运动和受精能力下降。
（2）人类精子染色体的研究：虽然所有染色体在减数分裂的联会过程后都有可能出现同源染色体共同移向一极而引起不分离，但是它们不分离的概率却不清楚。使用原位杂交和特殊染色体的探针技术，可以得到在人精子中1号、2号、4号、9号、12号、15号、16号、18号、20号、21号和性染色体成为双体的概率。Matin的研究显示：1号染色体双体的平均概率是0．09%；2号染色体是0．08%；4号染色体是0．11%；9号染色体是0．14%；12染色体是0．16%；15号、16号、18号染色体是0．11%；20号染色体是0．12%；21号染色体是0．29%；性染色体是0．43%。经过检验发现：性染色体和21号染色体比其他常染色体双体的概率有明显的升高。这些数据说明性染色体二价体和21号染色体二价体在生精过程中更有可能不分离。
通过精子核型研究表明，不育男性精子非整倍体有显著性的提高。这项结果在少精病人身上特别明显。精子数量异常（少精、无精）常与常染色体和性染色体的配对异常有关。Egozcue等报道在不育男性由于配对异常而引起的减数分裂受阻的概率升高，从而引起少精和染色体非整倍体。性染色体二价体最易引起染色体配对异常，因为它们在非常染色体区域只有一个交叉。Speed和Chandley研究了不育男性的正常体细胞的核型，发现与正常人相比其XY染色体联会概率减少。Hassold等进一步认为在减数分裂中XY二价体重组减少，从而导致47，XXY的核型。因此不育男性染色体重组和配对的减少非常有可能导致减数分裂受阻（少精）和染色体不分离（非整倍体）。
（3）流式细胞仪（FCM）对精子质量的分析：FCM是一种能快速（测105细胞／秒），精准定量分析细胞的高科技技术，能高效、多参数地测定细胞的各种成分（如DNA、RNA、蛋白质、抗原等），并可高纯度地分类收集细胞亚群，在精液和睾丸组织的检测研究，已显示了良好应用前景。
对精液等细胞的DNA含量测定，能分析精子细胞的成熟程度、增殖周期及异倍体精子等，通过FCM分析可分出精液中的细胞碎片、凋亡细胞、单倍体精子、圆形精子细胞、二倍体细胞（精子细胞、上皮细胞、炎症细胞等）、四倍体细胞和G0／G1期、S期、G2／M期细胞的含量及异倍体精子的含量，从而获得精液和睾丸组织中各类细胞相对比例的精确数据及精子形态学指标，对精子发生障碍的性质和程度作出客观精确的评价。在不育症研究特别是少精、无精、精子畸形的研究和临床诊断中FCM作用显著。
FCM可对精子染色体核型进行快速分析，并可分类收集不同类型染色体，研究精子染色体结构异常，以及与精子质量低下和男性不育、流产、畸胎、死胎等的关系，根据X精子和Y精子染色体含量的不同检测并分离纯化X精子和Y精子。
FCM对DNA倍体分析也可检测睾丸癌等生殖系统肿瘤，并进行疗效评估、预后判断。
此外用FCM可检测抗精子抗体，精子的各种蛋白质和抗原、细胞膜的完整性，精子线粒体膜电位、功能、数量与质量客观地反映出精子的活动能力。
2．2．3．2 研究内容目的与意义
本研究将运用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜对正常人群和农药接触引起的男性生殖功能异常和不育症患者的精液进行DNA含量倍体分析，测定精液中细胞碎片、凋亡精子、单倍体精子、单倍体球形精子、二倍体精细胞、体细胞、炎症细胞、四倍体细胞及S期、G0／G1期、G2／M期的各种细胞的数量和比例，同时也测定因精子在减数分裂时染色质分离异常等而致的精子染色质数量异常、异倍体，观察精子染色体的浓缩情况，以分析精液中精子的成熟状况。精子的成熟状况，精子染色质异常与不育、流产、畸胎、死胎、先天性缺陷等的关系。探讨农药接触等各种环境因素对精液质量的影响及可能机制，同时也建立正常男性精液质量状况的FCM检测的参考范围，对各种DNA含量倍体分析等质量异常的精液进行分类，为临床检测提供新的有效方法和参考标准。
进行本课题的研究，对于预防各种性传播疾病和环境因素引起的精液质量下降，提高不育、不孕的诊疗水平和提高我国人口素质，具有重要的理论意义、实用价值和深远的社会价值。
本研究的目的在于：①建立正常男性精液质量状况的FCM等检测的参考范围；②探讨环境因素对精子质量的影响；③为临床诊断、治疗环境因素所致男性生殖疾患提供有效的检测标准，为预防环境有害因素影响男性生殖健康提供防治决策依据。
2．2．3．3 技术路线和方法
本研究对农药接触者200例、对照200例进行分子流行病学研究。
应用FCM对精液样本进行DNA含量和倍体分析（采用美国BD Vantage SE流式细胞仪），观察分析精液中细胞碎片、凋亡细胞、单倍精子、圆形精子细胞、二倍体细胞（精细胞、上皮细胞、炎症细胞等）、四倍体细胞、异倍体细胞和G0／G1期、S期、G2／M期细胞。精子DNA的浓缩情况及精子成熟和畸形状况，比较农药接触人群与正常人群精液DNA及其他精子质量指标的差异。
采用激光共聚焦扫描显微镜对部分精液样本进行观察，研究农药接触人群精子的成熟状况、畸形变化、精液中各种细胞和有形成分改变。
对所有实验结果和研究资料根据不同性质采用t检验、χ2检验、相关性分析、多元统计分析等方法进行统计分析。
2．2．3．4 项目前期工作基础
在基础研究方面，研究参加单位南京医科大学在“六五”期间作为主要的牵头单位承担了国家计生委“六五”攻关课题“棉酚抗生育的可逆性研究”，1984年获国家计生委科技进步二等奖；20世纪90年代重点从事精子功能检测的研究，建立了多种检测精子功能的方法，1992年获江苏省政府科技进步三等奖；1992年起，将分子生物学技术引入生殖医学的研究，构建了人睾丸cDNA文库，筛选出人精子抗原的基因表达克隆，证明三株克隆表达产物的相关抗体具有抑制精子受精的能力，1995年获卫生部和江苏省政府科技进步三等奖；1995～1996年，承担了英国Wellcome Trust基金会资助项目，对睾丸雄激素生成酶的基因表达调控进行了研究。同时，还对精子发生的调控基因进行研究，建立了YRRMl，DAZ和DAZH基因及DYSl和DYS200基因座的检测方法和精子线粒体全长DNA检测方法，包括常规PCR，PCR－SSCP，半定量PCR，多重PCR和长链PCR方法，并已向全国推广用于临床检测，取得了较为满意的结果，1997年获国家计生委科技进步三等奖；自1997年以来重点应用差异显示技术克隆了104株人类生精细胞特异表达的基因克隆。近来又进行了精液DNA量及倍体FCM分析研究和激光共聚焦显微镜检测精液的实验研究。上述建立的方法和实验的结果为开展本研究奠定了基础。
2．2．3．5 项目执行期限，进度安排
1～3个月：进行实验准备和预试验。
4～18个月：收集精液标本并进行实验检测。
19～20个月：分析总结，完成课题。
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2．3 偏倚的防止及精液检查的标准化拟订方案和详细的质控措施
2．3．1 严格执行研究对象的选择条件
在年龄组20～49岁（生殖道感染、电脑人员、农药接触者）；无慢性病及生殖系统病史；禁欲天数统一为3～6天；收集标本前，对象应排除饮酒、高热等干扰因素。应用筛选表对研究对象进行严格的筛选。
2．3．2 采样条件控制
统一精液采集方法：全部采用手淫法收集，采集前受检者清洁双手及外生殖器；采样时气温要求在18～25℃；全国各中心采集标本的月份统一，防止因季节变动过大造成的偏差。考虑到现场的可操作性，春季（3月、4月、5月）完成35%样本量的任务，夏季（6月、7月、8月）完成15%样本量的任务，秋季（9月、10月、11月）完成35%样本量的任务，冬季（12月、1月、2月）完成15%样本量的任务。
2．3．3 现场质量控制
固定2～3个有经验的现场质量控制员；定期到各个研究中心巡视；定期召开质量控制研究会，便于及时发现问题，及时解决。
2．3．4 实验室检测方法控制
精液质量测定的各中心按照WHO《人类精液及精子－宫颈黏液相互作用实验室检验手册（第三版）》操作，血清激素与血清微量元素由指定单位采用统一的仪器设备、统一的试剂统一测定。
精液分析质量控制：由于精液内含有活的配子，且精液各参数易受多种因素影响，因此做好质量控制十分重要。
1）质量内控制：①精子浓度的质量内控制：每个中心都应采集混合精液样品，分以若干份，低温储存。定期测定精子浓度，每次误差不能大于10%。②精子活力的质量内控制：不同的技术人员检测同一份混合精液，技术人员间误差应小于10%。③精子形态的质量内控制；用混合精液制备一系列涂片，定期对涂片重复分析，精子正常形态率误差应＜10%。
2）质量外控制：为减少各中心之间的误差，采用以下方法：
a．统一培训：按世界卫生组织《人类精液及精子－宫颈黏液相互作用实验室检验手册（第三版）》的要求进行培训，做到统一方法、统一标准。
b．主要试剂及仪器统一：
血球计数板（上海医乐医用光学仪器厂生产）及专用盖玻片；
精密pH试纸（6．4～8．0）（上海试剂三厂生产，批号991009）；
刻度离心管；
新型巴氏染色试剂（上海虹桥医用试剂实验研究所研制，500ml，批号0010000）；
苏木素溶液（上海虹桥医用试剂实验研究所研制，500ml，批号00100001）。
c．定期抽查：对各中心的混合精液样品、由研究项目承担单位做定期检查，以保证各中心间误差＜10%。
2．3．5 化验员质量控制
对化验员统一培训。固定化验员：要求每个试验点固定一个具有中专以上文化程度的化验员。统一方法：采用WHO推荐的方法。质量控制：培训时，对一份样本，进行2次测定。直到测量值与“金标准”相差不超过5%，即认为该实验员符合标准，否则不能参加该项研究。定期培训：将每个点的实验员定期集中培训，在实验开始、中期均进行培训，及时发现问题，及时解决。
2．3．6 测定质量控制
要求每个样品至少测定两次。若两次测定的误差＜5%，则取其平均数；若两次测定值＞5%，则要求测量第3次，取两次接近值的平均数。样本保留，以便复查。分析仪器灵敏度、试药的纯度及试药的批号统一。操作技术熟练度、标准掌握程度一致并进行实验前后的一致性检验。对实验的仪器设备及检测时条件作详细记录。
2．4 统计分析方法
根据资料的性质、分布及目的综合考虑后确定统计分析方法。单因素分析将包括t检验、F检验、秩和检验、卡方检验，Poission回归等；多元统计分析包括多变量的线性回归、logistic回归等方法。应用各种统计方法分析不同地区间及城乡间的精液质量、性激素水平和血清铅、锰及镉水平是否有差异；精液质量（如用精子活力指数作为指标）与性激素水平，血清铅、锰、锌及镉水平之间是否有联系；精神因素、性发育、性行为因素、职业暴露、生活环境因素、文化程度及年龄等是否影响精液质量。
分析内容有以下几种：
（1）研究对象的人口学特征及其他背景特征
人口学特征：年龄、体质指数〔体重（kg）／身高（m）2〕、民族、文化程度、户口性质、职业、婚姻状况、人均年收入、人均居住面积。
（2）体格检查结果
1）一般体检内容：营养发育状况、血压指标，以及心、肺、肝、脾情况。
2）生殖器检查内容：阴茎长度、直径、包皮情况、阴囊情况、左右睾丸大小、附睾、输精管情况、静索静脉曲张情况。
（3）血液实验室检测结果
1）激素水平：LH，FSH，E2，T。
2）重金属水平：铅、锰、镉、铜、锌。
（4）精液质量检测结果
1）各指标描述（平均值±标准差，百分比）：平均禁欲天数、液化时间、粘稠度、pH值、平均精液量、精子快速前向运动、慢速前向运动、非前向运动及不活动的百分比、存活率、精子密度、一次排精总数、正常形态率、精子头部、颈部及尾部缺陷率、胞浆滴、圆细胞、脓球情况。
2）精液质量的地区差异：各地区精液参数间的差异。
3）不同禁欲时间精液参数间的比较。
4）不同亚人群精液质量状况：不同人口学特征及背景人群的精液质量指标的比较。
（5）精液质量影响因素的单因素分析
1）精液质量与人口学特征；
2）精液质量与性发育、性生活情况；
3）精液质量与幼时一些疾病史；
4）精液质量与生活习惯（吸烟、喝茶、饮酒、穿衣、洗澡）；
5）精液质量与家用电器、电子通讯；
6）精液质量与外生殖器卫生；
7）精液质量与外生殖器生理状况；
8）精液质量与精神因素；
9）精液质量与血清激素水平；
10）精液质量与血清重金属水平。
（6）生理指标与精液参数的相关分析：年龄、身高、体重、睾丸体积等与精液参数间的相关程度。
（7）重金属→激素→精液质量之间的关联程度：
1）重金属、激素、精液质量之间的相关分析。
2）重金属、激素、精液质量三组变量的典型相关分析。
（8）综合指标分析：
1）有效活精指数：精液量×精子密度×正常形态精子百分率×精子活动率。
2）生育力指数：精子活力得分×精子密度×精子平均运动速度／畸形精子百分率×103（常数）。
3）精液参数的主成分分析。
（9）精液质量的多因素分析
1）以精液质量的代表性指标为应变量，“可能影响因素”为自变量，进行逐步回归分析。
2）以WHO的标准或按中国的资料本身状况选择截点对精液质量进行二分类，然后进行logistic回归分析。
2．5 本研究的创新之处
（1）在全国范围开展多地域和多中心的环境与男子精液质量关系的研究。
（2）研究环境因素对精子染色体的影响。
（3）多部门、多学科对男性精液质量进行综合研究。
（4）采用FCM、激光共聚焦显微镜等现代技术对男性精液质量进行评估。
2．6 项目实施的地点及研究参加单位
上海：上海市计划生育科学研究所、上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）。
北京：国家计划生育委员会科学技术研究所。
南京：南京医科大学。
石家庄：河北省计划生育科学研究所。
郑州：河南省计划生育科学研究所。
青岛：青岛市计划生育科学研究所。
杭州：浙江省计划生育科学研究所。
太原：山西省计划生育科学研究所、太原市卫生防疫站。
贵阳：贵州省计划生育科学研究所。
2．7 项目管理
在项目实施过程中，项目管理是保证项目顺利实施的关键。
（1）项目将成立由国家计划生育委员会科技司牵头的项目领导小组，上海市计划生育科学研究所作为项目领导小组成员，负责项目总体规划、实施和协调工作。
（2）上海市计划生育科学研究所、国家计划生育委员会科学技术研究所、上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）及南京医科大学的流行病学、男性学专家、高级实验师组成专家组对项目的质量实施监督保证。
（3）各省计划生育科学研究所的流行病学、男性学、从事实验室工作多年的化验师、丰富现场工作经验的调查员负责项目的具体实施。
（4）项目领导小组每半年召开一次例会，处理项目实施中可能碰到的组织问题。项目专家组每半年召开一次例会，处理项目实施中可能碰到的专业问题。必要时可随时召开会议。
（5）各省计划生育科学研究所的主要研究人员必须定期前往研究现场，以保证研究的具体执行，尤其要保证研究严格遵照设计书进行。
（6）所有调查问卷由各省计划生育科学研究所的专人负责校对、整理，及时发现缺项、漏项，并由各省计划生育科学研究所的主要研究人员检查后定期寄往上海市计划生育科学研究所，由上海市计划生育科学研究所的专人负责编码、输入计算机，资料须由不同的两位工作人员双编输入，经计算机逻辑检查后，用标准的流行病学与统计方法分析所有数据。
（7）各省计划生育科学研究所的主要研究人员将负责现场指导工作，包括样本的选择、合格对象的确定、核对调查问卷，以保证所有问卷中的问题被正确的询问，并防止遗漏。
（8）所有参加该研究的男子在研究前将填写一份知情参与研究志愿书。
2．8 项目实施的设备
精液质量检测所需的显微镜各单位均已具备，原子分光光度计法测定重金属元素、放射免疫法测定激素、精液质量分子生物学实验所需的设备研究单位和协作单位也已具备。仪器主要有LKBβ－计数仪，286微处理机，高速离心机，混旋器，水浴箱，低温冰箱，日本产东芝HL—7000无火焰原子吸收仪，火焰原子吸收仪，美国Biogenics的精子CASA分析系统，美国B．D．VANTAGE SE的流式细胞仪，德国ZISS 510型共聚焦显微镜，美国RC—5C杜邦高速冷冻离心机，美国Beckman高速台式离心机，日本电子1010，荷兰PhilpEM400透射电子显微镜，日本日立S－450扫描电子显微镜，瑞典LKBⅢ型、Ⅴ型超薄切片机，德国ORTHOPLAN万能显微镜，美国AO公司冰冻切片机，无需添置大的设备。
3．原材料、水电汽基础设施和设备等外部支撑条件
仅需实验所需的一些试剂，无需特殊原材料、水电汽基础设施和设备等外部支撑条件。所需的试剂有25%过氧化氢溶液及浓硝酸溶液，巴氏染剂、Buffer液、闪烁液、活性炭、乙醚、标记试剂、睾酮抗血清、卵泡刺激素抗血清及β－抑制素抗血清，睾酮、卵泡刺激素及β－抑制素的放免试剂盒等。
4．项目环境污染情况
本项目研究中国正常健康男性的精液质量及影响因素，同时研究特殊人群（生殖道感染、电子视频作业、农药接触者）的精液质量状况及影响因素，该项目主要为流行病学调查和实验室检测，无环境污染。男性生殖激素所用的放免实验的原、废液按环保要求进行处理。
5．项目承担单位及主要参加单位的概况
承担单位：上海市计划生育科学研究所
主要参加单位：国家计划生育委员会科学技术研究所
南京医科大学
上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）
项目建议人：高尔生
6．项目执行期限、进度安排
1～3个月：设计调查表、培训调查员、制订工作流程及质量控制方案。
4～18个月：招收志愿者，完成调查问卷及体格检查表，收集精液并完成精液检查项目；采集血液，并完成血清检测项目；收集各地环境污染状况的资料。
19～24个月：完成特殊人群的精液质量分析；完成精液质量的有关分子生物学的研究。
25～36个月：对数据进行逻辑性、一致性检查；利用EPI－INFO建立数据库，双遍输入；利用SAS统计软件进行统计分析；撰写报告、发表论文并进行成果鉴定。
7．投资估算、资金筹措情况及来源
经费概算：
8．各单位承担任务及费用
（略）
9．项目的预期目标和社会、经济效益分析
研究结果将揭示内、外环境污染状况、个人行为因素、职业暴露等是否影响精液质量；了解血液性激素水平、重金属元素含量及空气污染程度与精液质量的关联程度，并为环境污染是否影响精液质量提供线索。
（1）计算并提供我国的正常人精液质量参照值范围。
（2）与历史资料进行比较，以发现我国的精液质量是否在下降或有下降趋势，对提高民族素质和国家制定相关政策具有重要意义。
（3）研究结果可能支持环境污染影响精液质量，提供有关环境卫生与计划生育部门，引起决策人的注意，为环境规划、环境污染的治理及其优生优育提供科学依据。
（4）研究结果可能支持个人行为因素是精液质量下降的危险因素，应引起宣教部门及广大民众的注意，规范个人行为，提高精液质量，优生优育，提高人口素质，为提高民族素质作出贡献。
10．项目的风险分析
本项目实施时可能会遇到一些问题，如对象拒绝参加本课题，对象手淫法采精困难，精液质量实验室间可能存在差异，微量元素测定回收率达不到较高水平等，但该项目不会有大的风险。通过研究某些影响精液质量的因素必然会有较明确的结果，有良好的社会效益。
