3 分析与讨论

目前的研究发现可以概括为: 骨骼肌热应激预处理诱导HSP70和αB-crystallin蛋白表达升高，对骨骼肌一次性大强度离心运动损伤具有保护作用。一次性热应激预处理使骨骼肌对损伤产生适应，使骨骼肌对离心运动损伤产生了交叉耐受(cross-tolerance)。

3.1 预热应激诱导热休克蛋白HSP70、αB-crystallin表达升高

类似于试验性离心运动损伤或者是缺血再灌注造成的损伤，热应激预处理是一种应激刺激，使很多代谢过程及细胞结构遭到破坏，如果超过一定的刺激阈值就会使细胞死亡[1][2][3]。热应激引起广泛的骨架蛋白损伤，包括丝样的中间丝蛋白网 (eg． Desmin) 崩溃，变成大的围绕细胞核的集聚体，细胞浆骨架蛋白网络重组，actin丝移位到细胞核，以及微管破坏[4][5]，线粒体肿胀，线粒体功能降低，氧化磷酸化脱偶联[6]等。热应激使起始因子磷酸化，导致总的蛋白合成抑制，而HSPs基因由于缺少内含子而高效率地表达，使应激蛋白优先翻译合成，几分钟内可达到细胞总蛋白的15%～25%[7]。

本研究利用温和热应激动物模型对大鼠进行预处理，结果使大鼠腓肠肌HSP70和αB-crystallin显著升高，其中HSP70在热应激后24h升高较多，αB-crystallin在热应激后即刻就有升高， 24h后仍保持较高水平。Diana A． Lepore[8]和Wilson YT等人[9]利用温和热应激模型使大鼠和兔子腓肠肌HSP70升高，明显减轻了骨骼肌缺血—再灌注损伤与本研究的结果相似。骨骼肌热休克蛋白的这种保护作用与热休克蛋白对其他组织或器官的保护作用的研究是相同的，例如在心肌，动物整体的预热应激可以诱导HSP70、αB-crystallin表达升高，而且这种表达升高与心肌缺血再灌注后梗死面积减少、肌肉功能改进以及CK泄漏减少相关。正如上文提到的那样，热应激预处理使骨骼肌对很多种生理刺激产生了“交叉耐受”现象，而这种“交叉耐受”现象与热休克蛋白表达升高是直接相联的。

3.2 预热应激对腓肠肌离心运动后最大强直收缩力变化的影响

Mc Ardle A，et al．[10]对不同年龄HSP70转基因小鼠和野生小鼠的趾长伸肌 (EDL) 进行试验性离心收缩致其损伤，在损伤后3h，3、14、28天对肌肉的最大强直收缩力进行了测定。实验结果表明，损伤后3h肌力下降最多，无论是转基因鼠还是野生鼠肌肉力量都下降了50%～70%，到3天野生鼠肌肉力量出现第二次下降，相比较转基因鼠的肌力没有出现第二次下降。Nikolaou[11]对拉伤的兔胫骨前肌，在拉伤即刻，1、2、7天进行了肌肉的最大强直力测定。结果发现，拉伤后第一天肌力下降最多，为正常的50．1%，在第7天基本恢复。Naito J等人[12]研究了预热应激对骨骼肌氧化损伤的早期阶段的保护作用，他们研究了H2O2对热应激及非热应激骨骼肌的损伤作用，分别观察了肌肉收缩力、脂质过氧化、肌肉超微结构变化等指标。研究结果表明，虽然H2O2对热应激和非热应激组都有损伤，但是在60min后只有热应激组肌肉收缩力出现了明显的恢复，提示热应激对骨骼肌具有保护作用。

本研究中，正常大鼠离心运动后即刻肌力下降44%，预热应激大鼠离心运动后即刻肌力下降了23%，到48h，正常大鼠肌力出现第二次下降，而预热应激大鼠肌力未下降，而是出现了恢复。本研究结果与Mc Ardle A等人的研究结果一致，说明了热休克蛋白过表达能够预防骨骼肌损伤及促进离心运动后骨骼肌机能恢复。热休克蛋白过表达影响损伤和再生过程也许是通过多种机制实现的。离心收缩后出现的二次损伤是与大量的吞噬细胞浸润以及自由基的增多有关的，Mc Ardle A认为增多的HSP70可能通过抗氧化作用提供保护，以对抗增多的自由基活动。

3.3 预热应激对离心运动后大鼠血清CK、LDH及自由基代谢的影响

用血清CK、LDH指标综合反映骨骼肌损伤的程度，用血清SOD、MDA及肌肉中SOD、MDA反映自由基代谢情况。

(1) 血清CK、LDH变化: 正常大鼠与热应激大鼠离心运动后CK变化与王瑞元 (2002)[13]研究结果类似，在离心运动后即刻最高，其后降低，并在24～48h又一次上升到较高水平，72h又下降。但是预热应激大鼠离心运动后即刻CK值虽然很高，但是比正常大鼠的值低，两者有显著性差异P＜0．05。离心运动后血清LDH的变化趋势与CK表现出相似的变化特征。值得注意的是预热应激大鼠和正常大鼠离心运动后CK、LDH变化主要体现在离心运动后即刻，两组运动后即刻CK值均较大，不但与对照组有显著性差异，而且两组之间差异显著 (P＜0．05)。说明离心运动对两个组大鼠细胞膜结构均造成损伤，但是预热应激组大鼠损伤较轻一些，这些实验结果说明大鼠骨骼肌在经过一次预热应激后诱导HSPs表达增高使骨骼肌出现了适应性变化，这样在接下来的离心运动中肌细胞损伤减轻。或者是由于提高了CK的清除率来解释目前的研究结果[14]。

Maglara A．A．等[15]建立了一个培养的C2C12骨骼肌细胞损伤模型，他们使用Ca2+载运体A23187和线粒体脱偶联剂2，4-二硝基苯酚 (2，4-dinitrophenol，DNP) 处理细胞使细胞损伤，分别使细胞CK释放达到63．5%和47．9%。当肌管经一段时间的高热处理诱导 HSP25、HSP70、HSP60 显著的增高后，再用A23187和2，4-dinitrophenol损伤细胞时，CK的释放显著减少。实验结果表明增加的HSPs也许提供保护，对抗细胞内由于Ca2+超载和线粒体呼吸链脱偶联造成的损伤。Marber (1994)[16]用大鼠心脏实验提供了相似的实验结果，他的试验证实了组织中预先增加的HSPs可以减少由钙超载引起的组织损伤。本研究利用文献上典型的大负荷离心运动模型造成骨骼肌严重损伤，关于离心运动引起损伤的机制尚不清楚，目前主要有两种假说: ①机械损伤假说: 在肌肉收缩/弹性系统中，由于高张力造成结构的损害。②化学假说: 运动使氧自由基增加，脂质过氧化加强; 胞浆钙浓度增加，线粒体大量堆积钙，抑制细胞呼吸，ATP产生能力下降，危及细胞主动逐出钙的能力，这种恶性循环造成氧化磷酸化的损害，并使细胞内钙更加升高，后者的升高激活一种钙依赖蛋白水解酶，此酶使Z线、肌蛋白和原肌球蛋白降解，对肌纤维结构造成了严重的损害。本试验的研究结果表明，离心运动造成的骨骼肌结构损害，可能是化学因素所致，因为本试验中预热应激大鼠离心运动后最大强直收缩力在48h内基本恢复至正常水平，而机械损伤假说对此难以解释，与田佳[17]的研究结论相一致。因此本研究利用预热应激诱导HSPs增加，很可能是通过抑制自由基、钙超载和线粒体呼吸链脱偶联，从而减轻骨骼肌组织结构的损伤，进而使CK和LDH释放减少。

(2) 血清SOD、MDA与肌组织SOD、MDA变化: 用总SOD代表机体抗氧化能力。本研究发现，热应激大鼠离心运动后肌组织SOD (m SOD) 比对照组和正常离心运动大鼠m SOD高，其中HE0组和HE2组与对照组相比有显著差异(P＜0．05)，与E1组相比也有显著性差异 (P＜0．05)。血清SOD (b SOD) 变化趋势与肌组织SOD变化趋势相似，热应激运动组大鼠SOD值均比对照组和正常大鼠离心运动后的值高，其中HE1组和HE2组b SOD显著高于对照组和E1组(P＜0．05)。

研究结果表明无论肌组织还是血清，预热应激大鼠运动后SOD值均高于正常大鼠运动后的SOD，说明热应激可以提高机体的抗氧化能力。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)是一类金属酶，能催化氧自由基发生歧化反应，从而将其清除。自由基 (free radical) 是指具有不配对电子的原子、分子、原子团或离子基团，是一类具有高度化学活性的物质。氧自由基(oxygen free radical) 是指含氧的自由基。在机体中，生理状态下氧自由基通过脂质过氧化参与了细胞更新、吞饮、胞饮等过程，当其过多时，这种脂质过氧化就会因其对生物膜的液态性、流动性、通透性等巨大影响而对细胞及亚细胞器如线粒体、溶酶体等造成破坏。由于SOD能清除氧自由基，故其在防御氧的毒性、抗辐射损伤、预防衰老、防治肿瘤和炎症等方面有着极其重要的意义。

Yamashita (1998)[18]研究发现预热应激可以使大鼠心肌抗氧化酶Mn-SOD和热休克蛋白72表达增加，与本研究的结果一致。SOD与热休克蛋白在应激状态下的密切关系在转基因动物中也得到了证实，例如利用转基因小鼠使HSP70过表达可以提高心肌抗缺血再灌注损伤，Mn-SOD也同步地表达增加[19]。说明SOD与热休克蛋白在细胞保护作用方面可能具有联动作用，或是互补作用。但是热应激对骨骼肌抗氧化防御系统的影响还未见研究报道。Zuo (2000) 研究报告膈肌经30min42℃热处理后导致超氧阴离子显著性增加，关于生物体在应激状态下SOD和热休克蛋白的产生机制，业已证明氧自由基不仅诱发了抗氧化酶的表达[20]，而且也起着热休克蛋白基因表达触发器作用，并且热休克蛋白基因表达一旦被触发，即使补充SOD以促过氧化物短暂歧化仍然不足以抑制随后热休克蛋白的积聚。总之，关于骨骼肌预热应激、HSP表达、抗氧化酶表达和细胞保护之间的关系值得进一步研究。

用MDA代表机体脂质过氧化情况。肌组织MDA值，无论是热应激大鼠运动后MDA还是正常大鼠运动后MDA值均比正常对照组MDA值高，但与对照组相比没有显著性差异 (P＞0．05)，热应激大鼠运动组和正常大鼠运动组相比，MDA值变化不明显，没有显著性差异 (P＞0．05)。血清MDA值变化与肌组织MDA值不同，正常大鼠运动后MDA变化不明显; 预热应激大鼠运动后MDA值显著低于正常对照组 (P＜0．05)，而且也低于正常大鼠运动后的MDA值，说明预热应激有效地降低了组织脂质过氧化水平，起到了保护作用。

Childetal． (1999)[21]研究了人体膝关节进行70个离心运动后的抗氧化状态、脂质过氧化以及炎症变化情况，研究结果表明无论是血清还是肌肉组织MDA值均未发现变化。Hellsten et al． (1997)[22]报告了相似的发现，肌肉组织MDA值在连续膝关节离心运动后没有变化; Lenn et al． (2002)[23]研究了肘关节在进行50个离心收缩后的MDA变化情况，结果也没有发现变化。本研究采用间歇性大强度离心运动模型，发现正常大鼠离心运动后无论是血清还是肌肉组织MDA值变化不明显，与对照组没有显著差异，这个发现与上述文献中报告的情况相似。预热应激大鼠离心运动后肌肉组织MDA变化不显著，而血清MDA值却显著性的低于正常对照组水平，研究结果从一定程度说明预热应激有效抑制了离心运动后组织脂质过氧化的发生。

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