实验材料与方法

1 实验材料与方法

1.1 实验动物与分组

1．1．1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠，体重300～360g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，自由饮食，室温17～23℃，相对湿度60%～75%，保持12h光照。适应性喂养1周后随即分组。

正式实验前3天，所有动物进行5～10min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10m/min，坡度为0°。大鼠跑台为杭州段氏制作BCPT-98型。

1．1．2 实验分组

动物分为正常组和热应激组。正常组又分为对照组C、离心运动后即刻组E0、离心运动后24h组E1、离心运动后48h组E2;热应激大鼠分为热应激不运动组和恢复24h后离心运动即刻组HE0、离心运动后24h组HE1、离心运动后48h组HE2。热应激不运动组又分为热应激后即刻组H0和热应激后24h组H24分别进行观察，各6只大鼠 (见表2)。

1.2 动物热处理、运动方式和取样

1．2．1 建立大鼠预热应激模型

本试验由于预试验过程中发现麻醉剂加热应激对动物刺激较大，个别动物出现死亡和精神萎靡，不利于动物热应激后的恢复。所以经过反复试验摸索发现大鼠不经麻醉就能够耐受43℃热环境，而且此法比较接近实际，便于在人体试验中参考。因此在参考Currie[5]和Diana A． Lepore[6]的动物模型的基础上建立了非麻醉温和热应激动物模型，具体做法是: 将大鼠放进小铁笼中，然后放入预先加热至43℃的恒温鼓风干燥箱中，箱内保持湿度65%。20min时大鼠直肠温度达41．5～42℃，然后维持15min，总热应激时间约35min。恒温鼓风干燥箱为北京电器厂生产 (北京体育大学提供)，体温计为天津医疗器械公司生产的普通体温计。

1．2．2 大鼠离心运动方式

一次性离心运动实验大鼠以离心方式运动，模型采用Arm-strong (1983)[7]、田野[8]所设计的-16°下坡跑台跑，略有改进，以更适合模拟离心方式运动造成的损伤。定量大负荷间歇性运动，跑速为26．8m/min[9]，相当于最大摄氧量的80%～90%[10]，运动5min，间歇1min，共进行10组。给以少量声、光、电刺激，以激励大鼠运动。

1．2．3 测试样本的取材与处理

(1) 取材安排: 每组大鼠的左后肢腓肠肌用于肌肉最大强直收缩力测试。待力学测试完成后，快速取血和取右后肢腓肠肌并分别处理用于肌肉匀浆和石蜡切片的测试。

(2) 取血、匀浆及石蜡切片样本的采集: 大鼠称重后，用20%的乌来糖 (或称乌拉坦) 按0．01ml/g腹腔注射麻醉，心脏取血置于离心管中，倾斜静置2～3h后进行常规血清分离 (2000转/min，15min)，-20℃冰箱保存待测。

取血后在冰块上速取右侧腓肠肌外侧头，切约为 (4×4×4) mm3，用锡纸包好、标记后放入液氮中冰冻保存，留做匀浆用。把剩下的肌肉样品浸放在4%多聚甲醛中，样品应在48h内常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成石蜡块待用。

1.3 检测指标、仪器及主要试剂

(1) 骨骼肌HSP70和αB-crystallin蛋白分析采用免疫印记Western-Blot方法: SDS-PAGE电泳使用瑞典LKB2301电泳仪和北京六一仪器厂生产的电泳槽，低分子量标准购自华美生物公司，使用YLN-2000凝胶影像分析系统进行定量分析。HSP70一抗为小鼠单克隆抗体，αB-crystallin一抗为兔多克隆抗体，美国Santa Cruz Biotechnology产品。

(2) 肌肉最大等长强直收缩力: 仪器为Mini MAT2000微型材料试验机 (清华大学材料系提供)，三导电刺激器 (NIHON KOHDEN北京体育大学提供)。

(3) 血清CK、LDH: 仪器为MD-100半自动生化分析仪。试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司。

(4) 肌肉匀浆测SOD、MDA: SOD的测试采用黄嘌呤氧化酶法，MDA的测试采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法，试剂盒均购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

1.4 测试方法与步骤

1．4．1 免疫印记Western-Bloting检测腓肠肌HSP70和

αB-crystallin蛋白表达

(1) 10%肌肉匀浆制备: 秤取腓肠肌肉样品，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，以1∶10的比例加入匀浆液进行匀浆。匀浆液为TE缓冲液 (50m MTris·HCl，p H7．4，5m MEDTA)，补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂(1m MNa3VO4，5m MNa F，1m Mphenyl-methylsulfonyl苯甲基磺基fluoride氟化物，1μMleupeptin亮肽素，0．3μMaprotinin抑肽酶)。

(2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离肌肉匀浆中的蛋白组分:将10%匀浆液4℃12000g离心20min，收集上清液。上清液蛋白浓度用考马斯亮蓝G250法 (Bradford法) 测定[11]，然后用上样缓冲液调整蛋白浓度至2μg/μl，在沸水中煮5min，制备好的蛋白样品晾至室温直接用于电泳或于-20℃冰箱保存备用，上样缓冲液 (5%β-巯基乙醇，100m M Tris，10%甘油，4%SDS， 0．05%溴酚蓝，p H6．8)。使用瑞典LKB2301电泳仪，每孔加样量20μl，电泳条件为: 82mm×82mm微型垂直板电泳槽，凝胶厚度0．75mm。分离胶浓度为12%，配比见表3。低分子量标准蛋白购自华美生物公司 (兔磷酸化酶B97．4k D，牛血清白蛋白66k D，兔肌动蛋白43k D，牛碳酸酐酶31k D，胰蛋白酶抑制剂20．1k D，鸡蛋清溶菌酶14．4k D)。样品通过浓缩胶时电压60V，分离胶时为90V。当溴酚蓝泳出凝胶下缘，取胶，进行电转移或在考马斯亮蓝 (R250) 染色液 (45%甲醇、45%水、10%冰乙酸、0．25%考马斯亮蓝R250) 中染色1～2h。

(3) 蛋白免疫印迹Westen-Blotting检测HSP70和αB-crystal-lin: 样品经过SDS-PAGE垂直板电泳后，进行凝胶电转移。在转移缓冲液中浸泡、平衡海绵垫、滤纸和硝酸纤维素膜 (NC膜)。打开转移框架，依次铺上海绵垫、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、海绵垫，用玻棒排去气泡，夹好后插入转移槽; 将NC膜一侧朝向正极，浸于转移缓冲液中，将槽放于冰浴中，100V电压转移1h。电转移、印迹用试剂见表4。

电转移完成后，取出NC膜，用3%的脱脂奶粉封闭，摇床摇0．5～1h; 用封闭液稀释一抗 (1∶500)，将NC膜放于小塑料袋内，浸于稀释的一抗中，4℃摇床过夜; 取出NC膜，用TTBS缓冲液浸洗4次，每次摇10～15min; 用封闭液稀释HSP70二抗羊抗鼠Ig G-HRP，αB-crystallin二抗羊抗兔Ig G-HRP，将NC膜放于另一塑料袋浸于稀释的二抗中，室温摇3h; 之后用联苯胺显色液 (DAB) 显色，DAB显色液 (DAB 10mg，10%H2O2 60μl，0．1mol/L，p H6．4磷酸缓冲液10ml)。

(4) 免疫印迹及结果分析: 使用YLN-2000凝胶影像分析系统进行定量分析。

1．4．2 肌肉生物力学性质的测定[12][13](https://www.daowen.com)

(1) 半离体状态腓肠肌试件制作: 称量大鼠体重，用20%的乌来糖 (或称乌拉坦) 按0．01ml/g腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定于大鼠固定板上，分离其左侧小腿后部皮肤及其表层肌肉、腱膜。用游标卡尺量取腓肠肌外侧头近端附着点至跟腱附着点之间的长度; 并量取腓肠肌距近端附着点1cm处肌肉周长。为保持肌肉正常血供，仅在距离踝关节上约0．5cm处剪断胫、腓骨，去除比目鱼肌，然后立即进行试验测试。使得肌肉收缩和材料力学特性的测试在肌肉半离体状态下进行。肌肉试件制作在3min内完成 (见图3)。

(2) 试件收缩力测定与计算: 腓肠肌试件安装在Mini MAT2000微型材料试验机上，经反复校准刺激前负荷定为1N。试验开始后以5mm/min的速率给肌肉加载至1N (牛顿) 使肌肉获得一定的初长度，然后用三导电刺激器以50V/75HZ交流电刺激肌肉，使其强直收缩，计算机自动采集收缩力的值，取肌肉强直收缩力最大值减前负荷1N作为肌肉最大强直收缩力 (见图4)，该力值除以肌肉的参考横断面积为该肌肉的收缩应力。

(3) 腓肠肌参考横断面积的计算: 本研究采用侯曼[14](1985) 报道的腓肠肌横断面积计算回归方程计算腓肠肌的横断面积，其回归方程为:

腓肠肌横断面积=1．060387+0．008371×体重-0．75597×肌肉长度+0．30825×肌肉长度

体重: 为大鼠的整体体重。

肌肉长度: 为大鼠位于跖屈90°时腓肠肌外侧头近端附着点至跟腱附着点之间的距离

周长: 为腓肠肌距近侧附着点1cm处的肌肉周长。

1．4．3 血清CK、LDH的测试方法

测试采用酶动力法，试剂盒购自北京北控中生生物科技股份有限公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为MD-100半自动生化分析仪。

1．4．4 肌肉匀浆测SOD、MDA方法

SOD的测试采用黄嘌呤氧化酶法，MDA的测试采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法，试剂盒均购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

1．4．5 数据统计方法

对观察分析结果用统计分析学软件SPSS10．0进行ANOVA单因素方差分析。

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[1]①Lindquist S，Craig EA． The heat-shock proteins． Annu Rev Genet． 1988; 22:631～677．

[2]②Ritossa F． Discovery of the heat shock response． Cell Stress Chaperones．1996; 1:97～98．

[3]Luc HEH． Snoeckx，Richard N． Cornelussen，Frans A． Van Nieuwenhoven，et al． Heat shock proteins and cardiovascular pathophysiology． Physiol Rev． 2001; 81: 1461～1497．

[4]Currie RW．，Tanguay RM．，Kingma Jr． JG． Heat shock response and limitation of tis-sue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit hearts． Circulation． 1993，87: 963～971．

[5]Currie R．W．，Tanguay R．M．，Kingma Jr． J．G． Heat-shock response and limita-tion of tissue necrosis during occlusion/resperfusion in rabbit hearts． Circulation． 1993，87:963～971．

[6]Diana A． Lepope，John V． Hurley，MD． Etal． Prior heat stress improves survival of ischemic-reperfused skeletal muscle in vivo． Muscle＆Nerve． 2000，23: 1847～1855

[7]Armstrong RB． Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle． J．Appl．Physio． 54: 80～93

[8]田野． 运动性线粒体钙聚积、细胞脂质过氧化对骨骼肌结构、机能的影响．北京体育大学博士毕业论文．1991年．

[9]Pica AJ，Brooks GA．Effects of training and age on VO2 max in laboratory rats．Med Sci Sports Exerc． 1982; 14 (3): 249～252．

[10]Bedfood，T．G． Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures in identically trained young and old rats． J． Appl． Physiol． 1979;17: 1278～1283．

[11]F． 奥斯伯等著，颜子颖、王海林译． 精编分子生物学实验指南． 北京: 科学出版社，2001．

[12]①张胜年． 实验性骨骼肌伤后训练的形态计量学生物力学研究． 上海体育学院博士毕业论文． 2000．6．

[13]②周里． 大鼠骨骼肌急性拉伤的生物力学及组织学研究． 上海体育学院博士毕业论文． 1998．12．

[14]侯曼． 大白鼠腓肠肌被动拉伸的力学性质的研究． 上海体育学院85届硕士论文，1985． 5