实验材料与方法
1.1 实验动物与分组
同第一部分。
1.2 测试样本的采集与处理
(1) 用于冷冻切片的样本采集: 大鼠称重后，颈椎脱位法处死，取血后小心剪取约(3×3×5) mm3的腓肠肌(切勿牵拉)投入用液氮预冷的装有正己烷 (-70℃) 的小烧杯中速冻，之后用锡纸包好放入液氮中保存，用于免疫荧光冷冻切片和原位杂交冷冻切片。
用于原位杂交的样本在SLEE冷冻切片机上进行切片，厚度为15μm，切片恒温-20℃。切片室温下空气干燥15～30min。切片浸入含有DEPC的4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定约30min。切片干燥后放入切片盒中，封口，-40℃冰箱保存。
(2) 用于取血及肌肉匀浆的样本采集: 同第一部分。
1.3 检测指标、仪器及主要试剂
(1) αB-crystallin基因表达: 原位杂交法。SLEE恒冷切片机切片，厚度15μm，切片恒温-20℃。原位杂交检测试剂盒为地高辛标记探针用超敏型，三大碱性磷酸酶AP检测系统。
大鼠αB-crystallin基因的寡核苷酸探针序列为: 5'GCTGTA GAGAAGAGGTCAGACTCCAACAGGTGCTCTCCGA3'。由北京奥科生物技术有限公司合成，3'端标记地高辛。
(2) 肌纤维类别鉴定及检测HSP70呈肌纤维类别的特异性分布: 异染性染料—腺苷三磷酸酶法，SLEE恒冷切片机切片，厚度15μm，切片恒温-20℃。
(3) 免疫荧光组织化学法 (immunofluorescence) 检测HSP70和αB-crystallin在腓肠肌细胞内的亚细胞分布:
冷冻切片机 (LEICA，德国) (北大医学部提供);
荧光倒置显微镜(OLYMPUSIS70，日本) (北大医学部提供);
HSP70一抗为小鼠来源单克隆抗体，αB-crystallin一抗为兔来源多克隆抗体，美国Santa Cruz Biotechnology产品。二抗: 异硫氰酸荧光素 (FITC，绿色荧光) 标记的羊抗兔Ig G，FITC (绿色荧光) 标记的羊抗鼠Ig G。
1.4 测试方法与步骤
(1) 原位杂交检测αB-crystallin基因表达情况: 首先从NCBI的基因库中查到αB-crystallin的Nucleic Acid序列，然后由北京奥科生物技术有限公司合成探针，选择的探针 (selected Primers) 序列为: 5'GCTGTAGAGAAGAGGTCAGACTCC AACAGGTGCTCTCCGA3'，3'端标记地高辛。(https://www.daowen.com)
原位杂交检测用试剂盒为鼎国生物技术有限公司产品，地高辛标记探针用超敏型，三大碱性磷酸酶AP检测系统。操作步骤如下: 多聚甲醛固定好的切片，每片滴加2～3滴1×proteinase K， 37℃孵育20～30min; PBS洗3次×5min，蒸馏水洗1次; 用不含探针的杂交工作液滴加于切片上，放入湿盒中，42℃，进行2～3h预杂交; 按探针制备比例按1∶9和杂交液混合，每张切片加1滴DNA探针/杂交工作液，加盖Parafilm膜; 将切片放入湿盒中，42℃，杂交过夜; 揭掉Parafilm膜进行洗脱，37℃左右水温2×SSC洗涤5min×2次，0．5×SSC洗涤15min×1次，0．2×SSC洗涤15min×2次; 滴加封闭液: 37℃ 30min，甩去多余液体，不洗; 滴加1滴兔抗地高辛-BSA，37℃ 60min，0．05mol/LPBS (5min×4次); 滴加1滴AP-羊抗兔Ig G，37℃60min，0．05mol/LPBS (5min×4次); NBT/BCIP显色: 每张切片加1～2滴显色液至标本上，37℃湿盒中显色，一般显色20～30min。若无背景出现可继续显色，充分水洗; 40℃干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
(2) 肌纤维类型测试方法: 冷冻切片用“异染性染料—腺苷三磷酸酶法”(Ogilvie和Feeback，1990[6]) (略有改动) 鉴别肌纤维类型。此法的优点是可在一张切片上同时鉴别I、IIa、IIb等多种肌纤维类型，不需做连续切片。
配制溶液: ①预培育液 (p H4．5～4．6): 蒸馏水230ml，醋酸钾1．23g，氯化钙 (2H2O) 0．65g (或无水Ca Cl20．56g)，用冰醋酸调至p H4．5～4．6后加蒸馏水至250ml。②Tris缓冲液:蒸馏水 470ml，Tris 6．1g，氯化钙 (二水) 1．30g (或无水1．12g)，用5NHCl调至p H7．8后，加蒸馏水至500ml。③培育液: 蒸馏水30ml，ATP二钠盐125mg，巴比妥钠206．2mg，氯化钙 (二水) 116．1mg (或无水100mg)，用0．1N或1N的Na OH调至p H9．4，加蒸馏水至50ml。④1%甲苯胺蓝水溶液: 0．5g加蒸馏水至50ml。⑤1%Ca Cl2·2H2O: 0．5g Ca Cl2·2H2O (或0．43g Ca Cl2) 加蒸馏水至50ml。
操作如下: 以晾干的冰冻切片入预培育液，在室温2min;经Tris缓冲液漂洗3次，每次2min; 入培育液，室温培育30min; 将切片在1%氯化钙 (二水) 水溶液内换洗3次，每次洗一次要漂洗切片4次; 在1%甲苯胺蓝水溶液内染色15s; 流动的蒸馏水冲洗切片，最多30s，或用500ml烧杯盛蒸馏水，洗去多余染液; 快速脱水 (用95%酒精换1次，每次沾漂5次，再经无水酒精2次)。此步骤宜快，以保持色调; 用二甲苯透明，换两次，每次5min，要充分沾漂。合成树脂封片。
结果判断: I型纤维绿松石色，即蓝绿色; Ⅱa型纤维淡粉红色，Ⅱb型纤维紫色。加工成黑白照片，则更易于判断准确。I型，深色; Ⅱa型，较深，均匀染色; Ⅱb型，中等染色深度，均匀染色。
(3) 免疫荧光组织化学法 (immunofluorescence) 检测HSP70和αB-crystallin在腓肠肌细胞内的亚细胞分布情况，试验步骤: 德国LEICA恒冷切片机切片，厚度5μm→充分晾干，丙酮固定10min→晾干后磷酸缓冲液(PBS) 洗3min→正常羊血清工作液封闭20min→之后加入一抗 (HSP70小鼠来源单克隆Ig G，αB-crystallin兔来源多克隆Ig G，分别用PBS按1∶100稀释) 37℃封闭1h→PBS洗3次，每次3min→分别加入二抗: 异硫氰酸FITC (绿色荧光) 标记的羊抗兔Ig G，FITC (绿色荧光) 标记的羊抗鼠Ig G，二抗用PBS按1∶200稀释，37℃封闭30min→PBS洗3次，每次3min→50%甘油/PBS封片→荧光倒置显微镜下观察并拍片。
(4) 组织切片的图像分析: 组织切片染色后，显微镜观察，通过Panasonic WV-CP410/G摄像头和BOSERBS602A图像采集卡进行图像采集，之后用Scion Image(national institutes of health，USA) 进行分析。每样本测量5个随机视野。
(5) 数据统计方法: 对观察分析结果用统计学分析软件SPSS10．0进行ANOVA单因素方差分析。
[1] Keith A． Webster． Serine phosphorylation and suppression of apoptosis by the small heat shock protein aB-crystallin． Circ Res． 2003，92: 130 ～ 132．
[2]② Golenhofen N，Ness W，Koob R，et al． Ischemia-induced phosphorylation and translocation of stress protein aB-crystalline to Z lines of myocardium． Am J Physiol． 1998， 274: H1457 ～ 1464．
[3]③ 肖卫民，袁开宇，袁灿，等． 热休克对心肌细胞中a B-晶体蛋白移位及表达的影响． 湖南医科大学学报．2001，26 (1): 1～3．
[4]④ 万华印，丁力，孔祥平，等． 酸枣仁总皂甙抗心肌细胞缺氧复氧损伤作用及其机理［J］． 中国病理生理杂志．1997，13 (5): 522～526．
[5]⑤ Mehlen P， Kretz-Remy C， Preville X， et al． Human HSP27， drosophila HSP27 and human alphaB-crystallin expression-mediated increase in glutathione is essential for the protective activity of these protein against TNF alpha induced cell death． EMBO J， 1996，15 ( 11) : 2695 ～ 2706．
[6] Ogilvie R． W． and Feeback D． L． A Metachromatic Dye-ATPase Method for the Simultaneous Identification of Skeletal Muscle Fibers Types I，IIA，IIB and IIC． Stain Technology 65，1990，5: 23