3 分析与讨论

3.1 热应激诱导热休克蛋白基因表达和蛋白表达与保护作用机制

目前的研究表明，热应激后恢复过程中αB-晶状体蛋白m RNA出现快速、高水平的表达，恢复24h后仍然很高，几乎是安静值的6倍。在热应激后恢复过程中αB-晶状体蛋白m RNA表达增高说明αB-晶状体蛋白可能在骨骼肌机能恢复过程中具有重要意义，为其在热应激预适应中参与保护作用提供了确凿证据。另一个突出的特点是从原位杂交图中可见αB-晶状体蛋白m RNA表达杂交信号主要位于肌细胞膜下，表明骨骼肌再重建过程中αB-晶状体蛋白的翻译主要在肌细胞膜下进行。这个发现与Neufer PD[1]等人的研究发现相类似，他们对兔的胫骨前肌进行低频运动神经刺激，第一天αB-晶状体蛋白m RNA就有5倍的增加，到21天时增加了20倍以上，他们的原位杂交结果也表明αB-晶状体蛋白m RNA的分布有肌纤维类型依赖性，而且分布在肌细胞膜下，原位杂交信号的形状类似“垂下的头发”(ringletpattern)。

应激蛋白的快速诱导是通过转录激活和优先翻译的机制完成的[2]，[3]。转录调控是HSPs合成的主要调控环节。HSPs的合成有赖于 HSPs 基因的转录活性，热应激能诱导细胞中的HSPm RNA 浓度迅速增高，除 m RNA 降解速度降低外， HSPm RNA合成增加是一个重要因素。HSPm RNA的转录调控有赖于HSPs基因上游的一段特殊DNA 序列，即热休克元件(HSE) 和细胞内一种与HSE特异结合的蛋白质，即热休克因子(HSF) 的结合。HSE是一段DNA序列，结构十分稳定，在热应激时主要通过对HSF结构的调节来实现对HSPs基因的转录调控。HSF的空间结构在热应激时可发生变化，增强与HSE的结合能力激活HSPm RNA合成。关于翻译水平的调控，对果蝇等生物体的研究表明热应激时细胞能选择性地翻译HSPm RNA。对果蝇HSPm RNA的结构进一步研究发现，其5'末端有一长的未翻译区域，可能这个区域与HSPm RNA的选择性翻译有关。热应激时，其他正常蛋白质的m RNA的翻译被抑制，从而减少与HSP m RNA的翻译竞争; 同时HSPm RNA在常温下是极不稳定的，而在热应激时则非常稳定。正是由于HSPsm RNA的特殊结构保证了其在热应激时的稳定性，从而保证HSPm RNA在热应激时得到优先翻译。

3.2 热休克蛋白的抗氧化作用是其保护作用机制之一

热应激使HSP70和αB-晶状体蛋白表达增高 (详见研究一)。研究表明HSP70和αB-晶状体蛋白具有抗氧化剂的功能，在抗氧化时，它们通过覆盖靶蛋白的敏感位点而发挥保护作用。当细胞内自由基过多超过抗氧化剂和热休克蛋白的抵抗能力时，热休克蛋白捕捉变性的蛋白质，并与之结合，直到变性蛋白再折叠或降解[4]。另外，热休克蛋白表达增多有助于内源性抗氧化剂的生成，从而提高细胞的抗氧化能力，例如，增高的αB-晶状体蛋白通过促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活动而提高细胞内还原型谷胱甘肽水平，有效降低了细胞的活性氧水平[5]。本研究发现热应激预处理显著提高了离心运动大鼠血清中抗氧化酶SOD含量，使离心运动大鼠脂质过氧化终产物丙二醛MDA水平明显降低，表明预热应激能够提高大鼠血清抗氧化酶水平，抑制自由基生成，具有保护作用。孙永建等[6]研究了热应激预处理对肢体缺血再灌注大鼠血清SOD、MDA的影响，研究结果与本文研究结果一致。Selsby JT[7]研究了热应激预处理对肢体固定的 (immobi-lized) 大鼠的肌肉体积和抗氧化能力的影响，研究认为热处理明显保持了肢体肌肉体积，提高了抗氧化能力，研究还认为，这种抗氧化保护作用不是经过抗氧化酶的作用，而是热休克蛋白在其中起了重要作用。类似的研究比较多，研究结果均表明热休克蛋白具有抗氧化作用。

3.3 肌纤维类别鉴定和热应激对HSP70呈肌纤维类别特异性表达的影响

通过甲苯胺蓝-ATPase染色的肌纤维类型鉴别及相邻切片免疫荧光组化切片观察发现HSP70只分布在Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维的细胞浆中，表达水平较低，但是热应激后发现HSP70发生了移位变化，移位到细胞膜上，除移位到Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维的细胞膜上外，Ⅱb型肌纤维的细胞膜上也有HSP70存在 (见图2-2-D和图2-6-B)。正常大鼠HSP70只分布在I型和IIa型肌纤维的细胞浆中，而热应激后HSP70表达增加，并且移位于所有肌纤维的细胞膜上，推测可能对预防细胞膜尤其是IIb型肌纤维的细胞膜损伤起到了保护作用。根据Neufer

PD (1996)[8]的研究，αB-晶状体蛋白正常情况下只存在于Ⅰ型肌纤维的胞浆中。而热应激后αB-晶状体蛋白表达增加，而且大量移位于Ⅰ型肌纤维的细胞膜和Z盘，热应激使αB-晶状体蛋白呈肌纤维类别特异性表达更加明显，可能对细胞膜和Z盘的骨架蛋白起保护作用。

3.4 热应激对腓肠肌αB-晶状体蛋白和HSP70亚细胞分布的影响与保护作用机制

通过免疫荧光组化切片显示，热应激后αB-晶状体蛋白和HSP70均表达增强，并且从肌细胞胞浆可溶性部分移位到不可溶性结构上面。在横切面上观察αB-晶状体蛋白热应激后移位到细胞膜，在纵切面上观察αB-晶状体蛋白热应激后移位到Z线附近，HSP70无论在纵切面还是横切面上观察均移位到细胞膜上。因为Z盘和肌细胞膜是最容易损伤的部位，而热应激后热休克蛋白快速移位到这些部位，可能具有稳定或修复这些部位的骨架蛋白的作用。

Timothy JK和J．Escobedo[9]研究发现小鼠离心收缩后即刻趾长伸肌Z盘骨架蛋白和细胞膜骨架蛋白dystrophin损伤，同时伴随αB-晶状体蛋白和HSP25移位到Z盘和细胞膜，作者推测αB-晶状体蛋白和HSP25在骨架蛋白损伤后快速移位到损伤的部位，可能帮助稳定或修复这里的骨架蛋白，使骨骼肌对离心运动诱导的损伤产生适应。Brady JP的研究表明αB-晶状体蛋白基因敲除的小鼠可发生一种以突发性肌肉降解为特征的骨骼肌疾病[10]。还有一种罕见的、家族性的以desmin中间丝蛋白聚集为特征的骨骼肌疾病，被认为与αB-晶状体蛋白基因变异有关[11]，这些研究说明了αB-晶状体蛋白与desmin的紧密关系以及在维持骨骼肌结构完整方面的作用。

与热应激后骨骼肌细胞内的情况相类似，缺血或热应激诱导心肌细胞Z盘骨架蛋白分解，同时伴随αB-晶状体蛋白从胞浆移位于Z盘[12][13][14]。研究人员认为细胞骨架蛋白在细胞中发挥许多重要的生理功能，如构成细胞的支架，维持细胞的形态，参与细胞的分裂、分化、运动及细胞内的物质运输等，而在肌细胞损伤时，细胞骨架的损伤发生很早，从而影响了细胞正常的生理活动。小热休克蛋白是与细胞骨架蛋白紧密相连的应激蛋白，当细胞骨架蛋白发生损伤时具有保护和修复骨架蛋白的功能。

类似于试验性离心运动损伤或者是缺血再灌注造成的损伤，热应激预处理是一种应激刺激，使很多代谢过程及细胞结构遭到破坏，如果超过一定的刺激阈值就会使细胞死亡。热应激引起广泛的骨架蛋白损伤，包括丝样的中间丝蛋白网 (eg． desmin) 崩溃，变成大的围绕细胞核的集聚体，细胞浆骨架蛋白网络重组， actin丝移位到细胞核，以及微管破坏[15][16]。而小热休克蛋白HSP25和αB-crystallin已经被证明能够保护各种类型的细胞，对抗各种应激刺激引起的骨架蛋白分解[17][18][19][20]。因此，αB-crystallin和HSP70可能对保护骨骼肌细胞，预防热应激引起细胞骨架蛋白损伤起作用。

本研究发现热应激后HSP70移位到细胞膜与细胞核，这个研究发现在骨骼肌的研究中还未见相关文献报道。与心肌中的研究也不完全一致，在心肌的研究中认为热休克后HSP70主要移位于细胞核，而细胞膜上没有发现。根据HSP70和αB-crystallin不同的移位变化，说明热休克蛋白不同家族成员在细胞损伤时可能发挥不同的功能，小热休克蛋白着重对细胞骨架蛋白的保护，而HSP70的保护可能与细胞核及细胞膜有关。

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