第6节 软骨肉瘤的基础研究进展
软骨肉瘤属成软骨性的恶性骨肿瘤，可从软骨细胞或间胚叶组织发生，可起源于躯体任何软骨内化骨的骨骼，是骨组织的第二大常见恶性肿瘤，约占骨肿瘤的4%，占恶性骨肿瘤的15%～20%。90%的软骨肉瘤是传统的软骨肉瘤，并可分为原发性软骨肉瘤和继发性软骨肉瘤两大类。原发性软骨肉瘤具有局部侵袭性和远处转移性，其病因及生物学行为的机制尚不明了；继发性软骨肉瘤多由内生性软骨瘤和骨软骨瘤恶变而来。去分化型、透明细胞型和间叶软骨肉瘤在软骨肉瘤中较少见，约占软骨肉瘤的10%。传统的软骨肉瘤分级较低，进展缓慢，发生转移的可能性小；分级高的软骨肉瘤转移的可能性大，并且转移的主要部位是肺，区域淋巴结转移和肝脏转移较少。
近年来，随着免疫组织化学和遗传学检测等辅助手段的兴起，越来越多的分子标志物被发现，并应用于诊断、治疗和预后评估等方面。目前普遍认为，软骨肉瘤的发病和各种肿瘤抑癌基因、致癌基因、细胞因子和错综复杂的信号级联放大途径都有关，并且同源染色体丢失、核型改变也关系到软骨恶变。
一、 异柠檬酸脱氢酶基因突变在软骨肉瘤中的作用
异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）是柠檬酸循环的关键代谢酶，有3种异构体：IDH-1、IDH-2、IDH-3。IDH-1位于细胞质和过氧化物酶体，而IDH-2和IDH-3位于线粒体。IDH催化异柠檬酸氧化脱羧生成二氧化碳和α-酮戊二酸（αKG）。DH1、IDH2基因突变最早发现于成人多形性胶质母细胞瘤患者中，后来许多研究报道在软骨肉瘤、急性髓细胞白血病、胆管癌、副神经节瘤、结直肠癌、前列腺癌、肺癌等不同类型的肿瘤中均检测到IDH1、IDH2基因突变。据统计，87%良性内生软骨瘤及50%以上的原发性软骨肉瘤都存在IDH基因突变的现象。
纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）研究了1991-2011年间的200名软骨肿瘤患者冷冻组织样本，并分析IDH1和IDH2以及IDH相关的遗传标记的突变情况，提出了两个假说：① 软骨肉瘤中的IDH1和IDH2的突变导致2-羟基戊二酸（2-HG）表达增多；② 这些突变导致的表观遗传变化，对细胞的生长和分化产生了严重影响。目前发现的IDH基因突变均为杂合型突变，这些突变大多数位于酶催化活性中心的保守区域，其中IDH1-R132、IDH2-R172是最常见的突变位点。目前针对IDH1 R132H位点突变的特异性抗体已经推向市场，在R132H突变的肿瘤中，其可以识别肿瘤蛋白的表达。
IDH的基因突变改变了酶的结合位点，使酶具有了新的活性。αKG不再产生，取而代之的是高水平的2-HG。2-HG在患者血清中积累，可以抑制αKG依赖的酶类活性，并对DNA和组蛋白进行甲基化修饰，导致多种肿瘤相关基因的表达。例如，TET是αKG依赖的DNA修饰酶TET家族的一员，可以介导DNA的去甲基化，而2-HG通过抑制TET的去甲基化而发挥对DNA甲基化的作用。再如，αKG依赖的JHKDMs通过修饰染色质以调控表观遗传学的基因表达，2-HG同样抑制了JHKDMs的功能。
IDH的基因突变和内生软骨瘤病相关的非遗传性的骨软骨瘤病（Ollier病）和Maffucci综合征存在很大联系。内生软骨瘤病有着较高的IDH基因突变频率，而且骨软骨瘤病和Maffucci综合征也是软骨肉瘤的早期事件。骨软骨瘤病和Maffucci综合征中，IDH1或IDH2的突变与肿瘤形成存在着因果关系。在软骨肉瘤中，IDH2突变已被证明和2-HG依赖的DNA甲基化相关，可以通过表观遗传的失调抑制间叶组织分化。而5-氮杂胞苷具有去甲基化的作用，可以解除分化抑制，也意味着这可能是一个潜在的治疗方式。AGI-5198是一种独特的IDH1突变抑制剂，在多种软骨肉瘤细胞株中都被证明可以减少至少90%的2-HG生成。但是在不同软骨肉瘤细胞株中，IDH对肿瘤细胞存活、增殖以及迁移能力的影响不尽相同。意味着软骨肉瘤中的表观遗传下调有着更加复杂的影响因素。有临床试验正在评估一些新的IDH抑制剂的临床效果。AG-221是口服IDH-2 抑制剂，目前处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验，聚焦于包括神经胶质瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和软骨肉瘤在内的多种伴有IDH2突变的实体肿瘤的研究（NCT02273739）。IDH抑制剂AG-881和AG-120也处于Ⅰ期临床试验，针对IDH1或IDH2突变的胶质瘤、胆管癌、软骨肉瘤正在研究中（NCT02481154/NCT02073994）。此外，有一个正在进行的一期、单中心、随机的临床试验，即评估氯喹联合二甲双胍治疗IDH1、IDH2突变的脑胶质瘤、肝内胆管癌或软骨肉瘤的疗效和毒性（NCT02496741）。基于上述数据，我们认为IDH抑制剂在软骨肉瘤的治疗方面有着广阔前景。
二、 Hedgehog信号通路在软骨肉瘤中的作用
Hedgehog（HH）的基因是在研究果蝇的基因突变时被发现的，是胚胎发育过程中细胞生长和分化的重要调节因子，通过调节干细胞的分化来维持后胚胎组织内的稳态。Hedgehog信号通路由信号分子（hedgehog）、膜受体PTCH（patched）、SMO（smoothened）以及某些中间信号转导分子和核转录因子神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1（glioma-associated oncogene homolog 1, GLI1）等组成。其中Hedgehog有3种同源基因，分别为SHH（sonic hedgehog）、IHH（Indian hedgehog）和DHH（desert hedgehog），这3种基因所编码的蛋白均可与PTCH受体结合，形成膜相关复合物而发挥生物学效应。当细胞外配体结合PTCH1，PTCH1介导的信号通路就会被SMO抑制。SMO被激活后，不仅激活由GLI家族锌指编码的转录因子，还可以导致包括GLI1和PTCH1在内的Hedgehog靶基因的表达。IHH/PTHrP途径对于软骨细胞分化有重要作用，并且最近的证据表明IHH信号通路在软骨肉瘤的发病机制中发挥关键作用。这一通路的异常活化可以诱导软骨细胞增殖，促进软骨细胞向软骨膜分泌PTHrP，而PTHrP可以介导软骨细胞分化和凋亡，从而维持细胞的增殖状态。当这个通路被下调后，其膜内受体PTCH1的表达以及下游转录因子GLI都 升高。
最近的一项关于原发性软骨肉瘤研究评估了一个口服的HH抑制剂IPI-926（赛瑞德吉，saridegib）对于肿瘤形成和生长的作用。结果显示，IPI-926对于人软骨肉瘤细胞株有着显著的抗肿瘤作用。总结以前的研究，IPI-926也被发现在基底细胞癌、髓母细胞瘤的异种移植模型中具有抗肿瘤作用，且这两种肿瘤也是和HH信号通路高度相关的。在另一项研究中，在人类软骨肉瘤SW1353细胞株中给予HH通路抑制剂-4（HPI-4），肿瘤的增殖能力、侵袭性以及迁移能力显著下降。还有研究人员用siRNA敲除GLI1，发现包括PTCH1和SMO在内的HH通路的重要分子的表达均下调，并且软骨肉瘤细胞的生长和存活均受限。这些研究结果为探索通过HH通路阻断治疗HH通路异常激活的软骨肉瘤提供了可靠的 依据。
尽管临床前数据已经表明，IPI-926对很多肿瘤都有抑制作用，但是一项面对晚期软骨肉瘤患者的Ⅱ期临床随机安慰剂对照试验的数据很不乐观。类似的，GDC-0449（维莫德吉，vismodegib）在很多1级或2级的传统性软骨肉瘤中展现出一定的活性，但是在一个Ⅱ期单组临床试验中，GDC-0449还不能达到6个月的临床获益。这些结果不尽如人意，意味着在软骨肉瘤中，HH通路的激活可能是非配体依赖性的，并且可能伴随有PTCH功能丧失的突变和SMO功能获得的突变。
三、 软骨肉瘤和Src通路
Src和Src蛋白酪氨酸激酶家族的其他成员在调节细胞表面受体的信号转导中起着关键作用。已经在几种肿瘤中观察到c-Src通路的激活，这种激活与细胞存活、血管生成、增殖和迁移密切相关。Src在人肉瘤组织（平滑肌肉瘤、高恶性骨肉瘤）和肉瘤细胞系（骨肉瘤、Ewing肉瘤、横纹肌肉瘤）中被激活，并且在滑膜肉瘤细胞中已被确认为一种磷酸化程度最强的激酶。因此，有人提出Src在人肉瘤的信号转导中起到了重要作用，包括骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤和Ewing肉瘤。基于这些发现，Src成为了药物开发的新靶点，许多如达沙替尼（dasatinib, BMS354825）等Src抑制剂目前处于不同的开发阶段。达沙替尼是一种小分子抑制剂，以各类酪氨酸激酶为靶点，包括ABL、SRC家族激酶、c-KIT以及PDGFR-α和PDGFR-β。达沙替尼在肉瘤细胞系中对Src通路的抑制取得了治疗效果，有效预防了生长和转移；而在另一项研究中，9个软骨肉瘤细胞培养中有7个出现细胞活力下降。
尽管达沙替尼作为单一药物已经在软骨肉瘤中显现出临床前活性，但是达沙替尼与其他抗肿瘤药物联用治疗软骨肉瘤的证据仍在积累中。Oosterwijk等人证明了达沙替尼在克服化疗耐药性方面的有效性，并成功致敏软骨肉瘤对多柔比星治疗有效，特别是在TP53突变型软骨肉瘤细胞系中。相反，SARC009试验，即对以前接受过治疗的高恶性晚期肉瘤（包括软骨肉瘤）的患者进行的达沙替尼Ⅱ期研究，得出达沙替尼作为单一药物无效的结论。因此，Src抑制剂可能需要同其他化疗方案联合用于治疗肉瘤。
四、 软骨肉瘤和PI3K-Akt-mTOR通路
PI3K-Akt-mTOR通路在各种正常细胞过程中具有重要的作用，包括细胞增殖、生长和存活。该通路的激活是通过受体酪氨酸激酶（RTK）的配体活化进行的，如IGF-1R和PDGFR-α和PDGFR-β。PI3K通路的异常活化与各类肿瘤的发生相关，并且该通路的活化增强通常与肿瘤对细胞毒性疗法的抵抗有关。基于这些认识及其对细胞生长和存活的关键作用，该通路成为了药理学干预的靶点。抑制mTORC1的雷帕霉素类似物依维莫司（everolimus）和替西罗莫司（temsirolimus）是批准用于治疗肾癌的首例PI3K通路靶向药物。随后，一系列的PI3K通路抑制剂进入了临床评估。
在最近的研究中，很多RTK在软骨肉瘤细胞中被激活，并在介导细胞生长中发挥着关键作用。在69%的传统性软骨肉瘤和44%的去分化软骨肉瘤临床样本中检测到S6激酶（PI3K-mTOR通路活性的替代物）的强磷酸化，这表明细胞系中PI3K-AktmTOR通路的激活在临床上与肿瘤是相关的。该研究显示RTK抑制剂抑制了Akt和S6激酶磷酸化，从而考虑软骨肉瘤细胞中的RTK活化与PI3K-AktmTOR信号传导是相互关联的。使用双重PI3K/mTOR抑制剂BEZ235的处理后，软骨肉瘤的异种移植模型中软骨肉瘤细胞系的生长显著减缓，这表明对PI3K/mTOR通路的抑制是一种很有效的治疗 策略。(https://www.daowen.com)
另一项研究是在大鼠中央型肉瘤模型中，对植入的肿瘤行R1切除术，在残余病灶中观察多柔比星和（或）依维莫司作为单一药物或联合使用时的抗肿瘤作用。作为单一药物使用时，多柔比星在抑制肿瘤生长方面是无活性的，而依维莫司从大体上看，对肿瘤进展具有较强抑制作用，在具有微小残留病灶的小鼠体内，也显著延迟或阻止了肿瘤复发，但是其与多柔比星的组合没有显示出协同效应。这些临床前数据支持mTOR抑制剂作为治疗软骨肉瘤的单一药物使用，并且支持软骨肉瘤患者在手术后使用依维莫司作为长期辅助治疗。一项针对10例不能切除的软骨肉瘤患者的回顾性研究显示，患者接受了mTOR抑制剂西罗莫司与环磷酰胺的联合治疗后，耐药性良好，疾病控制率为70%，意味着临床治疗有意义。最近报道了一项Ⅰ期/Ⅱ期临床试验，评估了替西罗莫司强化脂多糖多柔比星细胞毒作用的能力。该研究第一阶段数据证明了该药物对成人和患儿的安全性，研究的第二阶段扩展部分正在进行中。将继续研究依维莫司对原发性或复发性软骨肉瘤患者的作用，目的在于评估依维莫司作为新辅助治疗的疗效和安全性（NCT02008019）。
IGF-1R介导的PI3K-Akt通路的激活机制在一系列恶性肿瘤（包括肉瘤）中均有描述，它是一种内在的mTORC1抑制剂抗性机制。许多肉瘤亚型中都报道有IGF-1R的过表达现象。临床前数据表明mTOR与IGF-1R抑制剂联用导致Akt活化的抑制和药物诱导的抗增殖作用的增强。这项认知推动了几项早期临床试验的设计，以评估mTORC1和IGF-1R的组合对肉瘤的抑制作用。早期结果表明，相比于每种药物单独使用，两者联用可能具有更好的临床疗效。PDGFR-α是另一种RTK，可以在肉瘤细胞株中介导雷帕霉素诱导的Akt的磷酸化。此外，对软骨肉瘤的蛋白激酶分析发现，相比于其他通路，PDGFR通路在软骨肉瘤中过度活跃。
R1507（IGF-1R抑制剂）的Ⅱ期试验招募了复发的或难治的骨骼和软组织肉瘤患者，并证明了R1507是安全和良好耐受的，但临床疗效有限。另一项Ⅱ期研究用IGF-1R抑制剂西妥木单抗（cixutumumab，IMC-A12，一种完全人IgG1单克隆抗体）治疗晚期或转移性骨和软组织肉瘤的患者，结果表明，西妥木单抗耐受性良好，脂肪细胞肉瘤患者受益良多。另外一项Ⅰ期临床试验正在探索针对不可切除、局部晚期或转移性软组织肉瘤患者联合使用西妥木单抗与多柔比星的安全性、有效性及最佳剂量（NCT00720174）。
意大利的肉瘤小组在伊马替尼（imatinib）Ⅱ期试验中招募了26名患者。伊马替尼是一种多重酪氨酸激酶抑制剂，包括对PDGFR的抑制。在复发的且无法手术切除的软骨肉瘤患者中，免疫组织化学结果显示其PDGFR表达均为阳性。尽管伊马替尼耐受良好，但试验未能证明有意义的临床疗效。一项面对PDGFR-α和PDGFR-β阳性的骨髓肿瘤和软骨肉瘤患者的试验也正在评估伊马替尼的疗效（NCT00928525）。
五、 软骨肉瘤和组蛋白脱乙酰酶抑制剂
组蛋白的乙酰化修饰是调节基因表达的关键机制，并在确定细胞分化状态中发挥着核心作用。组蛋白修饰的调节在各类肿瘤类型中均有发现，并已成为重要的治疗靶点。现已知表观遗传改变可以改变基因表达及表型，扰乱体内平衡并促进肿瘤生长，这使得组蛋白脱乙酰酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACI）成为了肿瘤治疗的热点。组蛋白乙酰化后，可以改变染色质结构，在修饰基因表达中具有重要作用。组蛋白乙酰化异常状态与各种疾病的发展密切相关。在很多肿瘤中，组蛋白H4都表现有Lys16处的去乙酰化和Lys20的三甲基化。目前，美国FDA批准了4种HDACI用于治疗难治性皮肤T细胞淋巴瘤（vorinostat/ZOLINZA and romidepsin/ISTODAX®）、外周T细胞淋巴瘤（belinostat/Beleodaq and romidepsin）、复发和（或）难治性多发性骨髓瘤（panobinostat/FARYDAK）。临床前数据显示，HDACI可以诱导肉瘤的肿瘤干细胞以及软骨肉瘤细胞的生长停滞、凋亡和分化，因此一项Ⅱ期临床试验正在研究单一药物罗米地辛（romidepsin）在转移性或不可切除性的软组织肉瘤中的作用（NCT00112463）。临床前试验和早期临床试验的临床效果表明，这类药物在软骨肉瘤中的作用值得进一步研究。
六、 软骨肉瘤血管生成方面的研究
血管生成是肿瘤生长、进展和转移的标志性特征，在过去20年里已被证明是重要的治疗靶点。越来越多的临床前数据显示，血管生成与软骨肉瘤的发病机制密切相关。此外，随着组织学分级的增加，血管生存能力也在增加。奥安替尼（orantinib, SU6668）是RTKs Flk-1/KDR（VEGR2）、PDGFR-β 和FGFR1的抑制剂。在软骨肉瘤动物模型中，SU6668呈现出生长抑制作用，这似乎与SU6668的抗血管生成作用有关。塞来昔布（celecoxib，血管生成的一种介质）对COX-2的抑制已经在4个高分级的软骨肉瘤细胞系中进行了测试。体外实验中给予塞来昔布，可使得细胞活力降到最低。对来自66例患者的传统的中枢和外周软骨肿瘤进行了COX-2蛋白表达的免疫组织化学评估，其中65%呈阳性。尽管肿瘤在治疗6周后出现了复发，但肿瘤生长中的初始反应还是可以体现出塞来昔布的作用。
NCT01330966 Ⅱ期研究旨在研究单一药物帕唑帕尼（pazopanib）在不可切除的或转移性软骨肉瘤患者中的疗效和安全性。帕唑帕尼是一种有效的和选择性的多靶标RTK抑制剂，可抑制c-KIT、FGFR、PDGFR和VEGFR等酶。此外，NCT02066285 Ⅱ期试验也在不可切除或间隔性孤立性纤维性肿瘤和骨骼外骨髓样软骨肉瘤的患者中检测帕唑帕尼的作用。瑞戈非尼（regorafenib）是另一种口服多激酶抑制剂，针对血管生成、基质和致癌RTK发挥作用。面向转移性的骨组织肉瘤患者的Ⅱ期研究（NCT02389244）正在对瑞戈非尼的作用进行 测定。
七、 其他靶向治疗
雌激素受体是长骨骨骼生长的关键调节因子，由长骨骺板中的软骨细胞分化和增殖产生。人们已经在软骨肉瘤中确认了雌激素和芳香酶受体的表达，这表明这些肿瘤可能对雌激素和芳香酶信号传导抑制敏感。然而在一项研究中发现，体外和体内研究均显示芳香酶抑制剂对传统的软骨肉瘤增殖并无 影响。
单克隆抗体PRO95780（drozitumab）是一种促细胞凋亡的受体激动剂，靶向针对DR5，后者在许多血液恶性肿瘤和实体瘤中都有表达。它可以激活外源性凋亡通路，并在多种人类肿瘤细胞系和异种移植模型中诱导细胞凋亡。一项关于PRO95780对晚期恶性肿瘤患者作用的Ⅰ期研究发现，一例软骨肉瘤病例表现出了对该激动剂的反应；但另一项关于PRO95780在晚期软骨肉瘤患者中作用的Ⅱ期研究由于缺乏疗效而已被终止（NCT00543712）。
INI-1/hSNF5是一种肿瘤抑制基因，编码SWI/SNF染色质重塑复合物的亚基，在大多数正常细胞中广泛表达。INI-1/hSNF5的突变或缺失在恶性横纹肌瘤、上皮样肉瘤中已有报道。组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2由EZH2基因进行编码，通过H3K27的甲基化抑制基因表达。EZH2突变或过表达与各种癌症的发生有关，与预后不良相关，因此EZH2一直是抗癌治疗的理想靶标。EZH2抑制剂阿特珠单抗（tazemetostat）在Ⅱ期研究中进行临床评估，招募成年INI-1阴性肿瘤患者，包括骨骼外黏液样软骨肉瘤或复发/难治性滑膜肉瘤（NCT02601950）。此外，阿特珠单抗正在被一项针对儿童复发性或难治性INI-1阴性肿瘤或滑膜肉瘤进行的Ⅰ期研究进行测试（NCT02601937）。
具有免疫检查点抑制的免疫治疗是目前许多恶性肿瘤（包括肉瘤）研究的热点。PD-1及其配体（PD-L1）是细胞毒性免疫反应的关键抑制因子，它们的相互作用导致T细胞反应的下调。据研究，阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用具有较强的抗肿瘤作用。Kostine等人报道了在一系列传统的间质透明细胞和去分化软骨肉瘤中的PD-L1蛋白表达的分析，只有去分化软骨肉瘤呈PD-L1阳性，而其与免疫浸润细胞的相关性及近50%的去分化软骨肉瘤中的HLA Ⅰ类分子表达，为针对这些患者尝试PD-1/PD-L1靶向治疗提供了依据。针对晚期软组织肉瘤和骨肉瘤的抗PD-1抗体派姆单抗（pembrolizumab，MK-3475）的Ⅱ期研究（SARC028）初步结果显示，33%的未分化多形性肉瘤和去分化的脂肪肉瘤患者出现了肿瘤大小的缩小，而除外去分化软骨肉瘤的6例患者中仅有1例显示出部分肿瘤缓解。这些结果意味着在这些肉瘤类型中需要进一步进行研究。
八、 展望
过去几年的研究主要集中在对软骨肉瘤发病机制的分子事件的研究，并推动了几个新的潜在治疗靶点的认知。尽管早期临床研究中的结果不一致，但大多数的靶点在临床前研究中表现出有意义的抗肿瘤活性。未来的研究应进一步探讨这些候选分子靶向治疗在软骨肉瘤患者不同亚组中的效用。