第4节 骨肉瘤的基础研究进展
骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，每年在15～19岁的青少年中的发病基数为800万～ 1 000万。随着科学和医疗卫生的发展，对骨肉瘤发病机制以及转移机制的研究不断深入，新辅助化疗出现，现如今骨肉瘤的治疗已经是由肿瘤科、外科、病理科、放射科等多学科经验丰富的医师紧密合作共同完成。骨肉瘤的5年生存率大大提高（50%～60%），并且绝大部分（90%以上）的肢体骨肉瘤患者可行保肢治疗。
一、 骨肉瘤可能的发病机制
大部分骨肉瘤患者中，发病原因尚无具体定论。但由于骨肉瘤好发于青少年，与青春期骨组织的快速生长发育不无关系。研究发现，辐射照射也是诱发骨肉瘤的一大因素。钍与镭均可致骨肉瘤。约有40%与放射有关的骨肉瘤发生于或邻近中轴骨。良性骨肿瘤恶变导致的骨肉瘤较少见。骨生成障碍恶变出现大量骨痂形成也可导致骨肉瘤。罕见的是骨肉瘤可能发生在骨梗死的基础上。另外，以抑癌基因突变为代表的基因突变或多种遗传性疾病导致的遗传性视网膜母细胞瘤患者中也有较高的骨肉瘤发病率。大约10%成视网膜细胞瘤患者有家族史，其他30%有多灶病。这组患者能将该病传给后代，这种遗传倾向是由第13号染色体左臂上13q14位点控制的，在这种人群中骨肉瘤的发病率比其他人群高 2 000倍。近来数据表明，成视网膜细胞瘤的肿瘤组织与13q左臂部分有纯合性，这一发现提示13q的纯合性可能是成视网膜细胞瘤和骨肉瘤同时发生的根本原因。
二、 骨肉瘤细胞的起源
现代研究认为，鉴定肿瘤起源的细胞系-肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）意义重大。CSC在研究肿瘤发生、发展以及对治疗后的预后评估十分重要。可能并不同源，但与只是反映肿瘤表型的细胞相比，CSC的一些重要标志物显得更有价值，这一点已经在诸如前列腺癌、乳腺癌、基底细胞癌及胰腺癌中得到论证。目前研究认为，由于间充质干细胞可定向分化为成骨细胞，因而前者被认为参与骨肉瘤细胞的起源。另一个事实-骨肉瘤好发于长骨的干骺端（干骺端组织中富含间充质干细胞和成骨细胞前体）也很好地支持这一论点。而随后的体外实验、转基因小鼠模型及恶性细胞与间充质干细胞基因序列的比较也相继验证了这一点。除了骨肉瘤，其他肉瘤类型也存在此共性，如未分化软组织肉瘤。
三、 骨肉瘤的肿瘤异质性
骨肉瘤的诊断是基于恶性成骨基质细胞的组织学发现，后者能够产生很多类骨性基质（osteoid matrix）。骨肉瘤在病理学上存在很多种亚型，包括成骨细胞型（osteoblastic）、成纤维细胞型（fibroblastic）、成软骨细胞型（chondroblastic）、上皮样（epithelioid）、富于巨细胞型（giant-cell rich）、小细胞型（small cell）和毛细血管扩张型（telangiectatic），具有各自的组织细胞学或放射学特征。骨肉瘤细胞往往存在异常的染色体核型。现代的基因测序发现，骨肉瘤细胞存在一共同现象：染色体碎裂，即一种灾难性的基因不稳导致的染色体重组，进而出现上百种的融合基因产物。巨大的肿瘤异质性往往使得试图寻找可靠的生物标志来指导治疗、预测预后变得十分困难，同时也使得骨肉瘤广泛耐药的出现，甚至复发或者转移。现代研究认为，骨肉瘤病灶中存在一种多能肿瘤干细胞（multipotent CSC），具有自我更新和多向分化潜能，被认为是肿瘤耐药的根源。目前研究技术能够将具有一定干细胞潜质的骨肉瘤细胞亚群鉴定并分离出来，但尚无明确的标志物来鉴定此亚类。
四、 骨肉瘤的骨代谢微环境
在骨转移活跃的肿瘤类型中，例如乳腺癌和前列腺癌，肿瘤细胞和破骨细胞之间的相互作用在促进肿瘤细胞增生方面发挥了重要作用。这种所谓的恶性循环在骨基质中释放了大量的生长因子，使肿瘤细胞广泛增殖和扩散。而针对上述异常标志物的靶向药已成为研究抑制骨肉瘤增殖的热点之一。最新研究发现，GRM4的水平在骨组织的形成和吸收过程及骨肉瘤的易感性中起着重要作用。另外，RANL/RANKL/OPG轴的紊乱被认为与骨肉瘤的发生、发展有关。
五、 骨肉瘤的相关信号通路
目前研究发现，Notch、Wnt、Hedgehog、PI3K/AKT-mTOR及JAK/STAT通路均在骨肉瘤的发生、发展中扮演着重要的角色。Notch通路是一条相对保守的信号通路，因其多功能性，易受到信号组分异常活化的影响而出现相应的畸形和恶变。例如Notch通路中的姜黄素（curcumin）组分可通过下调Notch1及其下游靶基因Hes - 1、Hey - 1和Hey - 2的水平以增加活性氧水平，进而诱导细胞凋亡。Wnt通路则与细胞的迁移、分化、胚胎器官的形成以及干细胞的自我更新等有密切关系。Wnt通路可激活细胞内级联反应，包括Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）依赖性和非依赖性途径。目前研究发现Wnt/β-连环蛋白依赖性途径中，信号组分白藜芦醇（resveratrol）可靶向作用于β-连环蛋白和组蛋白H2AX，通过下调β-连环蛋白和c-Myc的mRNA和蛋白水平诱导细胞凋亡，而组蛋白H2AX的磷酸化则可导致染色体端粒结构的失稳和DNA结构的破坏。目前研究发现，约70%的骨肉瘤样本涉及Hedgehog信号通路中的组分，后者被认为在多种肿瘤的发生、发展中起着关键作用。该信号通路中的组分环杷明（cyclopamine）可与SMO（G蛋白偶联受体类似蛋白）结合，阻断相关信号传导，进而导致骨肉瘤细胞凋亡和增殖受抑。而在PI3K/AKT-mTOR信号通路中，PI3K可与相应配体结合，自身被磷酸化而活化，通过激活AKT而使mTOR活化，促进细胞的增殖和生存。在JAK/STAT通路中，相关的细胞因子或生长因子可与骨肉瘤细胞表面的受体结合活化JAK2蛋白，使得相应酪氨酸磷酸化，同时JAK2蛋白也可使招募的信号转导因子磷酸化，STAT出现二聚化，转移至细胞核内诱导相关靶基因的表达。
六、 骨肉瘤与miRNA
微小RNA（microRNA），简称miRNA，是一类长21～23个核苷酸的非编码单链小RNA分子，它主要通过调控蛋白质的翻译来发挥功能。主要通过与mRNA的3’UTR区域结合，从而发挥抑制mRNA翻译或直接切断mRNA的作用。目前的研究表明，miRNA在多种生命过程中，如生长发育，细胞分化、增殖、凋亡，肿瘤发生等方面，都起着不可替代的作用。并且单个miRNA往往存在多个目的蛋白，一个蛋白的表达往往又是由多个miRNA共同调控，而一些蛋白又可以调控特定miRNA的表达水平，这使得miRNA与蛋白间形成了一个庞大的调控网络。生物信息学分析表明，人类大约1/3的基因可能受到miRNA的调控。miRNA在不同器官、组织的表达各异，在同器官的不同部位表达也不尽相同。近期的研究同样也证实了miRNA与肿瘤的发生、发展、转移等都密切相关。这一节我们主要从常见的原发骨肿瘤入手，以miRNA作为分子诊断标志物，简述miRNA对肿瘤细胞行为的影响。
（一） miRNA作为骨相关肿瘤的分子诊断标志物的相关研究
miRNA作为细胞内常见的基因表达调控相关分子，直接从蛋白质翻译的水平对细胞功能进行了广泛的调控。作为细胞内常规的生物学过程，以及miRNA相对分子质量较小的特点，miRNA可以多种形式分泌到细胞外，并进入血液、淋巴液以及组织液中，这种特点使得利用在血液中检测miRNA的含量，并通过相关的标准来对某些肿瘤进行诊断成为可能。
1. miRNA作为骨肉瘤肿瘤标志物的相关研究 Fei D等研究人员通过比较118例骨肉瘤患者与60例正常人血清中miR-9的含量，发现骨肉瘤患者的miR-9显著增高。同时，研究人员发现miR-195也可作为骨肉瘤血清学诊断标志物，其在骨肉瘤血清中呈显著降低。Ma W等在对89例骨肉瘤患者血清中miR-148的研究中发现，miR-148a不仅可以作为骨肉瘤分子诊断标志物，还与肿瘤大小及患者5年生存率密切相关。研究人员还发现利用检测肿瘤实体标本中miR-22的含量也可以对骨肉瘤进行分子诊断。
2. miRNA作为软骨肉瘤肿瘤标志物的相关研究 研究人员发现miR-185及miR-30a在软骨肉瘤标本中降低，同时miR-218的含量显著升高，这3种miRNA可以作为软骨肉瘤的分子诊断标志物。
3. miRNA作为骨巨细胞瘤肿瘤标志物的相关研究 在骨巨细胞瘤中，研究人员发现miR-126-5p及miR-30a在骨巨细胞瘤中均有所降低，并通过调控PTHrP、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13, MMP-13）以及Runt家族核心转录因子2（runt-related transcription factor 2, RunX2）影响骨巨细胞瘤相关的骨溶解机制，并可以作为骨巨细胞瘤潜在的分子诊断标志物。(https://www.daowen.com)
4. miRNA作为多发性骨髓瘤分子标志物的相关研究 在对多发性骨髓瘤的研究中，Sevcikova S等研究人员检测了与多发性骨髓瘤密切相关的4个miRNA，包括miR-29a、miR410、mIR142-5p和miR660，发现miR-29a可以作为诊断多发性骨髓瘤的血清学标志物。
（二） miRNA对常见原发骨肿瘤细胞行为的调控作用
1. miRNA调控骨肉瘤的相关研究 作为最常见的原发骨肿瘤之一，骨肉瘤恶性生物学行为的分子机制研究一直是骨肉瘤基础研究急待解决的问题。而miRNA调控骨肉瘤恶性生物学行为的研究已有较大的进展。高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1 protein, HMGB1）是骨肉瘤生物学功能中的重要蛋白分子，其可以促进骨肉瘤细胞的自噬并加速肿瘤的增殖与运动能力，调控骨肉瘤的恶性生物学行为。研究人员发现与瘤旁细胞相比，miRNA-22在骨肉瘤细胞中表达含量显著降低，并且在骨肉瘤细胞中，miRNA-22无法调控抑制HMGB1的表达，使得HMGB1相关的自噬及肿瘤细胞的增殖和运动能力均大幅提高，同时还影响了基于HMGB1骨肉瘤的化疗抵抗作用。
miR-23a也是骨肉瘤相关miRNA研究的热点。研究人员发现miR-23a不但可以调控缝隙连接蛋白-43（connexin-43, Cx43）与RunX2来影响骨肉瘤相关的骨微环境，还可以调控细胞趋化因子12（cellderived factor 12, CXCL 12），通过自分泌和旁分泌途径影响骨肉瘤的恶性行为。miR-23a还可以通过与AT序列结合蛋白1（special AT-rich sequence-binding protein 1, SATB1）的3’-UTR结合，并调控SATB1的表达来影响骨肉瘤细胞的增殖。以往的研究发现miR-133是一种肌肉特异性的miRNA，其通过对多种关键蛋白的调控影响肌源性疾病的发生与发展。在骨肉瘤的研究中，人们发现miR-133家族不但可以作为骨肉瘤特异性的分子标志物，而且可以调控骨肉瘤细胞的增殖、运动性、侵袭性以及上皮细胞间质化的过程。
CD44被认为与骨肉瘤恶性侵袭能力密切相关。研究人员发现miR-199a-3p可以通过直接调控CD44的表达来影响骨肉瘤的侵袭能力，同时还可以通过调控AXL受体酪氨酸激酶（AXL receptor tyrosine kinase）来调控骨肉瘤的恶性行为能力。而miR199a-3p的切割共同产物miR199a-5p还可以作为骨肉瘤诊断的分子标志物。
miR34家族是骨肉瘤相关研究中的热点。miR-34家族是进化中的一类高度保守的miRNA家族，其中miR-34a基因位于1p36，单独转录表达，而miR-34b和miR-34c则是作为一个基因簇共同转录表达。miR-34a作为单独表达的基因可以作为骨肉瘤的特异性分子标志，并直接调控CD44的表达来影响骨肉瘤的侵袭能力；另外两个共同表达的miRNA中，miR-34b是可以进入循环系统的miRNA，可以作为潜在的骨肉瘤分子标志物以及骨肉瘤药物作用的靶点，而miR-34c对骨肉瘤恶性行为以及抗药性均有较大的影响。
2. miRNA调控软骨肉瘤的相关研究 目前的研究发现，FAK、Wnt、JAK-STATs及CaMKⅡ-p38通路在软骨肉瘤的发生、发展中具有较重要的调控作用。CaMKⅡ-p38通路的激活被认为在多种肿瘤中起重要作用，Tsai CH等人发现miR-519d可以通过调控MMP2的表达，介导了CaMKⅡ-p38通路的活性，进而影响了软骨肉瘤的增殖与凋亡。而脂连素蛋白通过抑制miR-27b，调控了通路，并介导了淋巴管生成的过程，这在软骨肉瘤增殖及侵袭的过程有较重要的肿瘤学作用。Wang CQ等人发现miR-206在软骨肉瘤血管生成过程中发挥重要作用；VEGF-A是调控肿瘤血管生成的重要细胞因子之一；miR-206可以抑制FAK/c-Src/PKC通路，上调VEGF-A的表达，促进软骨肉瘤的血管生成；同时miR-381也可以通过调控VEGF-C来调控软骨肉瘤的血管生成。FAK/c-Src/PKC通路在软骨肉瘤侵袭及转移的过程中也有广泛的作用；研究发现芍药醇通过miR-141调控FAK/c-Src/PKC通路，抑制了软骨肉瘤细胞的侵袭转移能力。而在Wnt通路的调控中，miR-129通过对SOX4/Wnt/β-Catenin轴的抑制作用，实现了抑制软骨肉瘤增殖及侵袭的调控。
3. miRNA调控骨巨细胞瘤的相关研究 骨巨细胞瘤主要由3种细胞构成，包括骨巨细胞瘤基质细胞（giant cell tumor of bone stromal cell, GCTSC）、单核细胞及巨细胞。目前的研究认为，GCTSC是骨巨细胞瘤中支撑肿瘤永生化的主要细胞类型。GCTSC具有永生化的特点，并通过释放大量细胞因子，引起单核细胞向多核巨噬细胞转化，最终引起肿瘤的增殖及骨质的破坏作用。
上海长征医院骨肿瘤外科肖建如研究团队，对miRNA调控骨巨细胞瘤增殖、骨破坏、血管生成等机制进行了较系统的研究：RunX2是骨骼系统特异性转录因子，广泛地调控着成骨功能；成骨与溶骨作用的动态平衡；各类骨前体细胞的增殖与分化等。该团队发现miR-30a在GCTSC中表达显著降低，同时miR-30a通过对RunX2的调控抑制了骨巨细胞瘤巨细胞的分化成熟，并降低了骨巨细胞瘤溶骨性骨损伤。PTHrP作为溶骨性骨损伤的重要调节因子，在骨巨细胞瘤导致的骨破坏发生过程中起重要作用。该研究团队还发现miR-126-5P可以抑制GCTSC中PTHrP的表达及分泌，并显著影响GCTSC介导的单核细胞向多核破骨细胞的分化作用，同时miR-126-5P还影响了MMP-13的表达，抑制了GCTSC对MMP-13的分泌及对骨基质的破坏作用。肖建如研究团队还发现，miR-106b可以直接调控GCTSC中RANKL的表达，从RANKL-OPG-NFkB通路来调控骨巨细胞瘤溶骨性骨破坏的肿瘤学功能。同时Fellenberg J等人发现，miR-127-3p及miR-376a-3p在骨巨细胞瘤中通过靶向COA1、GLE1、PDIA6等靶基因，可以改变骨巨细胞瘤增殖、骨破坏等相关恶性表型。
4. miRNA调控其他原发性骨肿瘤的相关研究 miRNA在其他原发性肿瘤中的研究还未形成系统、全面的研究热点及方向。在脊索瘤中，miR-1被发现可以通过抑制slug蛋白调控脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力，同时miR-1还可能成为脊索瘤预后诊断的潜在分子标志物。Zou MX等人发现miR-140-3p与脊索瘤预后不良也有显著的相关性，也可作为判断脊索瘤预后的潜在分子标志物。
在Ewing肉瘤的研究中，miR-34a被发现可以调控Ewing肉瘤Notch相关的NF-kB信号通路并影响Ewing肉瘤的分化，同时miR-34a可作为Ewing肉瘤预后诊断的分子标志物。EWS-FLI1融合基因被认为是Ewing肉瘤发生过程中的重要基因改变，而CD99是近几年发现的参与Ewing肉瘤增殖及分化的重要因子。Franzetti GA等研究发现，MiR-30a-5p从功能上联系EWS-FLI1及CD99，在Ewing肉瘤增殖及分化中起重要作用。
（三） 展望
miRNA作为目前已知的，功能及研究方法相对明确的小分子RNA，近年来在骨相关肿瘤的研究中有大量的科学发现。miRNA作为细胞内蛋白质翻译水平调控的重要分子，以相互协同交错的网络形式调控功能相近，或处于上下游关系的靶蛋白群。这种调控方式区别于对单一蛋白的调控功能，而是产生更广泛、更群体性的功能影响。这使得未来利用miRNA作为基础，开发调控群体性细胞功能的高效分子药物成为可能。同时，miRNA可以分泌到血液等体液中，结合miRNA不易降解且较容易检测的特性，使miRNA非常适合作为分子诊断的标志物，对骨相关肿瘤进行常规诊断及肿瘤预后的判断。随着未来科学研究的发展，我们期待在骨相关肿瘤的研究领域中，miRNA相关研究能从基础领域尽快转化为能服务于临床一线的重要药物及分子靶点，为人类最终战胜骨相关肿瘤发挥重要的作用。
七、 骨肉瘤与长链非编码RNA
目前研究认为，长链非编码RNA（lnc RNA）参与调节骨肉瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移及细胞凋亡等。抑制lnc RNA TUSC7的活性可明显促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力。而HNF1A-AS1水平的下调可不通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路抑制骨肉瘤细胞的增殖。TUG1和PRC2协同作用可抑制骨肉瘤特异性基因表达，进而调控细胞周期。另外ODRUL的表达量在骨肉瘤肺转移的标本中明显升高，提示ODRUL可能与骨肉瘤的转移相关。同样的，MALAT1可通过激活PI3K/AKT通路促进骨肉瘤细胞的转移。而相关研究发现，lnc RNA MFI2可通过调节FOXP4的基因表达，促进骨肉瘤细胞的凋亡。通过体外实验抑制BANCR的表达不仅可抑制细胞增殖和侵袭，还可促进MG-63细胞系的细胞凋亡。另外，lnc RNA还可作为骨肉瘤的诊断标志物和预后指标，诸如lnc RNA FGFR3-AS1、HOTTIP等。
八、 笔者团队在骨肉瘤基础研究中的发现
团队先后发现通过敲除IRX2基因可以激活AKT/MMP9信号通路，进而抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭；三氮杂苯修饰的聚合物在TRAIL基因治疗骨肉瘤中有很好的应用价值；IRX2基因可以通过PI3K/AKT依赖性途径上调MMP2和VEGF的表达，进而介导骨肉瘤细胞的增殖和侵袭；TGF-β可诱导人骨肉瘤细胞中miR-202表达量上调，抑制肿瘤细胞凋亡，进而介导肿瘤的耐药性；P50相关的基因外RNA（PACER）的过表达可激活COX-2基因，进而介导骨肉瘤细胞的增殖和转移；miR-92b可靶向作用于RECK，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭；热休克转录因子1可促进骨肉瘤细胞系的增殖、迁移和侵袭；分离并鉴定了来源于脊柱的骨肉瘤细胞系NEO217等。