第5节 骨巨细胞瘤的基础研究进展
骨巨细胞瘤（GCTB）是一种良性、侵袭性的原发性骨肿瘤，占全身原发性骨肿瘤的3%～5%。其中女性患者的发病率略高于男性。绝大多数骨巨细胞瘤患者的发病年龄在20～40岁。该肿瘤好发于长骨的干骺端，常见于股骨下端、胫骨上端以及桡骨远端（图2-3），呈溶骨性破坏。肉眼观瘤组织呈灰红色，质软而脆，常伴有出血、坏死、囊性变而呈多彩性；瘤体周围常有菲薄的骨壳。X线表现为肥皂泡样阴影。根据影像学特征可将骨巨细胞瘤分为3级：Ⅰ级，静息型；Ⅱ级，活跃型；Ⅲ级，侵袭型。骨巨细胞瘤病灶内切除（刮除）后，20%～50%复发，5%～10%发生恶性变，转变为纤维肉瘤或骨肉瘤；并有少量的病例报道会发生肺转移（发生率为1%～4%）。
一、 骨巨细胞瘤的发病机制研究
图2-3 1 049例骨巨细胞瘤在全身的分布情况
目前认为骨巨细胞瘤的发病机制主要是骨巨细胞瘤中的癌性基质细胞分泌募集单核细胞的细胞因子，趋化单核细胞到达肿瘤部位，进一步在癌性基质细胞表达的RANKL作用下，融合形成多核的巨细胞；巨细胞在多种细胞因子的作用下，引起蚀骨反应，最终导致溶骨性破坏。然而引起骨巨细胞瘤发病的起始因素目前尚不明确。现有的研究证实，骨巨细胞瘤由3种细胞成分（巨细胞、单核细胞、骨巨细胞瘤基质细胞）共同组成，每一种细胞成分都具有独自的特征和功能。下面对这3种细胞成分进行逐一阐述。
（一） 多核巨细胞
骨巨细胞瘤的多核巨大细胞与体内的破骨细胞有很多相似之处，同时也是骨巨细胞瘤的主要病理特征之一，所以骨巨细胞瘤又被称为“破骨细胞样肿瘤”。巨细胞（giant cell）表达许多破骨细胞的标志性基因，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、组织蛋白酶K（cathepsin K）、碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ），以及许多调控破骨细胞活性的基因，如受体活化核因子-κB（RANK）、降钙素受体（calcitonin receptor）、整合素αvβ3（αvβ3 integrin）。此外，巨细胞还具有与破骨细胞相同的骨吸收能力。因此，有研究者将其从肿瘤组织中分离出来用作破骨细胞模型进行体外研究。与破骨细胞唯一不同的是，巨细胞可以融合许多单核细胞，使细胞体型变得巨大，细胞核数目甚至可以达到数百个以上。
破骨细胞的形成需要RANKL的诱导，当RANKL和RANK结合以后，激活T细胞活化转录因子（NFATc1）入核，促进破骨细胞分化基因的表达，比如组织蛋白酶K、TRAP、降钙素受体和整合素αvβ3等。而在骨巨细胞瘤患者血清中RANKL的浓度明显高于正常人。此外，在巨细胞中高表达的转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）也可能参与了巨细胞的形成。有研究结果显示，巨细胞中表达的C/EBPβ可以促进巨细胞本身表达RANKL。其次，PTHrP也可能促进RANKL表达，因为在正常的破骨细胞中PTH1R是无法被检测到的，然而骨巨细胞瘤的巨细胞却表达PTH1R。还有数据显示，巨细胞的细胞周期是停滞不前的，其周期蛋白D1（cyclin D1）大量累积，并伴随着介导G2期向M期转换的周期蛋白B1（cyclin B1）的缺失。
溶骨性破坏是骨巨细胞瘤的主要影像学表现。体外研究结果表明，巨细胞可以独立完成对骨片的吸收。它可以通过表达组织蛋白酶K溶解骨组织，表达小泡状的H+-ATP酶（V-ATPase）降解羟基磷灰石形成的矿物质结晶，同时表达TRAP酶对骨基质蛋白进行去磷酸化并协助破骨样细胞的迁移。这个过程与传统的破骨细胞进行骨溶解和吸收是一致的。但是在骨巨细胞瘤的组织样本中，可检测到大量基质金属蛋白酶（MMP），其中MMP-2和MMP-9 占主要成分。MMP是一类具蛋白溶解酶活性的锌依赖性内肽酶家族，可溶解许多细胞外基质。这些酶与骨伤愈合、骨质重吸收和肿瘤浸润等过程有关。基因芯片和PCR分析结果均显示MMP家族另外一个成员MMP-13在骨巨细胞瘤中也有较高水平的表达；骨巨细胞瘤还表达MMP-1、MMP-3、MMP-14 以及多种组蛋白酶。研究者还发现骨巨细胞瘤条件培养基中的某些刺激因子（如IL-1β和TNF-α）可以刺激癌性基质细胞分泌MMP-9。此外，巨细胞本身也表达细胞外MMP诱导因子（EMMPRIN），能够刺激MMP的产生。诸多细胞因子的相互作用最终导致巨细胞的形成及溶骨性破坏（细胞因子的来源和作用详见表2-1）。
表2—1 骨巨细胞瘤中重要的功能分子
注：按照其功能和细胞来源进行分类；S：基质细胞；M：单核细胞；G：巨细胞。
（二） 单核细胞(https://www.daowen.com)
骨巨细胞瘤的单核细胞（monocytes）是被癌性基质细胞分泌的趋化因子，包括基质细胞衍生因子-1 （SDF-1）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）招募到肿瘤部位的，进而在破骨细胞分化因子的刺激下融合形成巨细胞。这些单核细胞与破骨细胞前体细胞一样表达细胞表面分子CD68、HLA-DR、CD14、CD33、CD45和CD51。单核细胞的前体细胞占所有骨巨细胞瘤单核细胞的1/3，常被认为来源于血液。骨巨细胞瘤组织中含有非常丰富的血管，而且VEGF在肿瘤组织中高表达。VEGF能够促进血管内皮细胞的大量生成，从而形成丰富的血管，这就为招募单核细胞提供了良好的基础，同时为肿瘤生长提供了足够的营养成分。其次，VEGF本身也是参与招募单核细胞的细胞因子之一。免疫荧光染色结果显示，在骨巨细胞瘤中血管内皮生长因子受体1（Flt-1）与CD68共定位，表明单核细胞膜上具有VEGF受体，这就提示VEGF也参与了单核细胞的趋化 反应。
癌性基质细胞在完成对单核细胞的招募之后，可进一步分泌巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）促进单核细胞增殖。而且单核细胞分泌的IL-34也能促进自身的增殖或分化。同时，M-CSF还可以促进单核细胞表达RANK。RANK是RNAK配体（RANKL）的受体，当RANK与RANKL结合会介导单核细胞的融合形成多核的巨细胞。RANKL属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）超家族的膜结合蛋白，在骨巨细胞瘤中由癌性基质细胞产生。与正常组织相比，骨巨细胞瘤中的RANKL含量非常丰富。虽然骨巨细胞瘤中的癌性基质细胞也有表达RANKL的可溶竞争性受体-骨保护素蛋白（OPG），但是它的表达水平远不及RANKL，所以不能完全弥补RANKL引起的破骨细胞过度分化。
单核细胞有许多亚群，具体是哪一亚群融合形成巨细胞目前还不十分明确。最近的文献报道CD33阳性的单核细胞是形成巨细胞的重要组分之一。但CD14阳性的单核细胞，可以在体外形成破骨细胞，并且能和多核的CD33阳性的巨细胞融合形成双阳性的巨细胞。研究发现，当巨细胞形成后，并没有表达造血细胞的标志基因，如CD14和HLA—DR。因此，融合形成巨细胞的单核细胞来源还有待进一步证实。
（三） 癌性基质细胞
大量研究结果显示，癌性基质细胞（neoplastic stroml cell）才是骨巨细胞瘤真正的肿瘤细胞成分。首先，癌性基质细胞可以在体外快速、无限地增殖，并且能够在小鼠体内形成肿瘤，符合肿瘤细胞的基本特征。其次，在骨巨细胞瘤的癌性基质细胞中有一类Stro-1（+）的细胞群体，这类细胞具有干细胞样的特性；换言之，癌性基质细胞群体中存在骨巨细胞瘤的肿瘤干细胞。有临床数据显示，骨巨细胞瘤之所以有近50%的复发率，很可能是因为癌性基质细胞的残留；而且癌性基质细胞还表达间充质成骨前体细胞的标记基因，如骨涎蛋白（bone sialoprotein）、骨粘连蛋白（bone osteonectin）、Runt相关转录因子2（RunX2）以及骨钙素。骨巨细胞瘤的癌性基质细胞群和很多肿瘤细胞群一样本身就是一个异质群体，可能由多种分化阶段的细胞组成。体外培养结果显示，采用诱导成骨细胞分化的条件培养基培养癌性基质细胞，可以使其分化成成熟的成骨细胞，如果延长培养时间还可以形成矿化结节。而且骨巨细胞瘤的癌性基质细胞还可以在小鼠皮下形成成骨性肿瘤。另外，在有些骨巨细胞瘤的组织中可观察到小面积的类骨质。已有的文献报道，癌性基质细胞还能够像间充质干细胞一样分化成为脂肪细胞和软骨细胞。
核型分析显示，大部分骨巨细胞瘤都发生了非整倍染色体畸变，包括插入突变、缺失突变、异位突变，还有结构和数量上的染色体重排。当然，也有个别病例发生了整倍突变，然而这种整倍突变大部分发生在复发病例中。这就提示我们，骨巨细胞瘤的复发来源于单个癌性基质细胞或者少量的细胞群。另外，在骨巨细胞瘤中常常发生染色体端粒联合，即两个不同的染色体臂在它们的端粒末端融合在一起，而且发生这种融合的病例高达70%以上。在体外单独培养的癌性基质细胞同样可以检测到这种染色体异常。由于巨细胞并不会发生有丝分裂，而且这种基因突变只发生在CD68阴性表达的细胞中，所以也就可以排除单核细胞。因此，骨巨细胞瘤发生的遗传学改变理论上都来源于癌性基质细胞。据文献报道，某些染色体臂比较容易发生染色体端粒融合，包括11p、15p、9q和20q，但是其是否能预测肿瘤的某些病理特征依然未知，具体意义也不清楚。但是，有数据显示端粒酶在肿瘤的表达存在差异，提示染色体端粒的不稳定性可能是骨巨细胞瘤发生、发展的重要原因。尽管如此，这些遗传学改变并没有和临床分期、分级有机地联系起来，说明骨巨细胞瘤来源于一个统一的遗传因素的可能性不大。事实上，这些不稳定性可能提示各种遗传畸变可能会导致肿瘤生长出现不同的分期和 分级。
研究发现，肿瘤抑制蛋白p53的表达水平和其他调控细胞周期基因的表达水平对骨巨细胞瘤的发生、发展也起着至关重要的作用。有学者报道骨巨细胞瘤中的P53大部分都会发生突变，但也有实验证明这种突变不会发生在原发的肿瘤中，并且P53的突变和肿瘤的复发、恶变、转移都成正相关。在骨巨细胞瘤中检测到p53抑制剂-MDM2高表达，它能够通过泛素化降解p53，从而抑制其活性。此外，骨巨细胞瘤中泛素羧基末端水解酶L1（UCHL1）基因往往是非活化的，这将导致p53的不稳定和促进MDM2的积累。以上结果表明，在骨巨细胞瘤中p53的抑癌功能是不足的。有趣的是，有报道证明p53缺失的小鼠可以自发产生骨巨细胞瘤。另外，有实验结果显示，在癌性基质细胞中过表达MDM2的另外一种剪切形式可以促进肿瘤的生长，这种生长是非p53依赖的。所以，进一步研究p53以及其相关蛋白在骨巨细胞瘤的作用对于研发新型骨巨细胞瘤的治疗方案具有广阔的前景。
综上所述，我们不难发现骨巨细胞瘤的3种细胞成分是相互作用、相互依赖的（图2-4）。单一的细胞成分分离培养或者体内荷瘤，往往会失去骨巨细胞瘤原有的病理学特征，所以进一步研究细胞间的相互作用以及细胞复合成分的荷瘤是将来的重点。
图2-4 骨巨细胞瘤的细胞成分及其分泌的细胞因子
修改自Cowan RW, et al. Giant cell tumor of bone: a basic science perspective. Bone, 2013, 52(1): 238-246.
二、 动物模型研究
到目前为止，尚缺少成熟的骨巨细胞瘤动物模型。文献报道，直接将癌性基质细胞注射在免疫缺陷的小鼠皮下可以形成成骨性的肿瘤，却不能产生巨细胞。另外，将癌性基质细胞转染绿色荧光蛋白（GFP）后注射到小鼠胫骨内，虽然可以使其长期存活，但也不会形成溶骨性破坏和巨细胞。以上两种动物模型的不足之处是仅有癌性基质细胞存活成瘤，并没有完全复制出骨巨细胞瘤的临床特征。因此，单一的癌性基质细胞成分荷瘤不能完全模拟骨巨细胞瘤的性征。为此，有研究者直接将骨巨细胞瘤肿瘤组织种植在鸡胚绒毛囊膜上，肿瘤组织块可存活10天左右，并能在囊膜上看到明显的新生血管，但是病理检测结果显示骨巨细胞瘤组织并没有招募到鸡的单核细胞。然而，将骨巨细胞瘤组织块接种到nude小鼠皮下，肿瘤组织块并不能存活或形成肿瘤。因此，我们推测骨巨细胞瘤需要在骨组织的特殊环境中才有可能荷瘤成功。另有文献报道，在成骨细胞前体细胞特异性敲除P53的转基因小鼠中，有一只小鼠会出现骨巨细胞瘤，但这类转基因小鼠多数发生骨肉瘤。所以，建立完全模拟临床的或小鼠自发的骨巨细胞瘤动物模型还需要进一步的研究。