第4节 脊柱肿瘤的生物治疗
传统的手术治疗、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，近年来随着现代分子生物学、免疫学和细胞生物学等基础医学的飞速发展，生物治疗成为肿瘤的第四种疗法。广义的生物治疗包括分子靶向治疗、放免靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等全新的治疗模式；而狭义的概念是指通过增加免疫细胞数量，直接恢复和提高人体免疫功能，增强对癌细胞的免疫力而实现对肿瘤特异性免疫杀伤的细胞治疗及细胞因子治疗。骨软组织肿瘤领域的临床及科研人员也不断在细胞治疗方面探索，希望能通过新的治疗模式进一步延长患者无病生存期，降低远处转移的发生率。
细胞介导的过继免疫治疗按其作用机制分为两类：① 被动细胞免疫治疗，又名过继免疫治疗（adoptive immuno-therapy, AIT），是取患者自身的免疫细胞在体外活化、增殖后再转输入患者体内，使其在患者体内发挥抗肿瘤作用。这些效应细胞具有异质性，如细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）、NK细胞、巨噬细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer cells, LAK）和肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TIL）等。② 主动细胞免疫治疗，体外培养能在体内激发患者的特异性抗肿瘤免疫反应的细胞，如树突状细胞及各种疫苗。
针对骨肉瘤的免疫治疗可追溯到20世纪70年代。1972年Marsh的研究共入组28位仅有原发病灶的骨肉瘤患者，在接受截肢手术的同时分离患者骨肉瘤组织的白细胞，并输注给同种异体的其他患者。结果是令人兴奋的，和单纯手术患者相比，该组患者4年无病生存期达到了44%，而对照组仅有10%，发生转移的中位时间也是对照组的2倍以上（15±2个月与6±2个月）。然而同期的骨肉瘤细胞治疗报道对其疗效评价却是争议颇多。加州大学洛杉矶分校应用骨肉瘤细胞株全抗原作为疫苗免疫骨肉瘤患者，研究显示无论仅有原发灶还是已发生转移的患者，接受手术联合细胞治疗组和单纯手术的对照组总生存期均无差异。是什么导致差异的结果呢？事实上要实现T细胞的目标识别需要一个以上的效靶信号结合表达，例如主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）联合特定黏附分子（intercellular cell adhesion molecule, ICAM）的共表达。Tsukahara的研究显示20位骨肉瘤患者有12位患者瘤细胞表达HLA Ⅰ类抗原，从这类患者肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞具有很强的细胞毒作用，而且患者体内有抗骨肉瘤抗体。这些免疫活化信号的存在使此类患者无病生存期及总生存期远高于HLA Ⅰ类抗原阴性患者。免疫细胞体外活化不充分，不能有效地进行效靶攻击，可能是前期部分免疫治疗失败的原因。
一、 活化T细胞在骨肉瘤中的应用
T细胞是抗肿瘤的主力军，肿瘤特异性淋巴细胞主要效应细胞为肿瘤特异性的CTL，其来源有三：一是从切除肿瘤组织中分离TIL扩增获得。Théoleyre从27例骨相关肿瘤（骨肉瘤、Ewing肉瘤、骨巨细胞瘤、软骨肉瘤、浆细胞瘤和骨转移癌），分离了TIL，在体外培养体系和大鼠骨肉瘤模型中对同种异体和自体肿瘤细胞均有很高的裂解活性。二是经自体瘤苗免疫后从手术获取的淋巴组织中分离淋巴细胞，用CD3抗体和IL2扩增获得。三是在体外用负载肿瘤抗原的抗原提呈细胞或经灭活的自体肿瘤细胞诱导外周血单个核细胞获得细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cell, CIK细胞）是一种异质细胞群，其主要细胞成分是CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞，在培养体系中增殖倍数最多，杀瘤活性也最强，是主要的效应细胞。
寻找肿瘤相关性抗原（tumor associated antigens, TAA）是提高肿瘤免疫疗效的关键环节，找到这些抗原，通过传统的抗原提呈细胞递呈或是基因修饰的方法均可显著提高T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤效率。表11-14总结了可能成为骨肉瘤TAA的各种抗原，表11-15 总结了目前用于骨肉瘤T细胞免疫治疗的修饰基因。
T细胞受体（T cell receptor, TCR）由两个不同的肽链以双硫键链接组成，体内90%的TCR是由α和β链组成，带有此种TCR的T细胞即α/β T细胞；而另有约10%的T细胞TCR是由γ和δ链组成，即γ/δT细胞。目前α/β T细胞携带的TAA包括GP100、MAGEA3、MART1、NY-ESO-1等。NYESO-1修饰T细胞在黑色素瘤治疗中取得良好效果。25%滑膜肉瘤患者NY-ESO-1表达阳性，Robbins等将NY-ESO-1修饰的α/β TCR T细胞治疗用于18个HLA-0201患者的转移性滑膜肉瘤，该项多中心研究显示此疗法有效性为64%，患者3年和5年生存率分别为38%和14%。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors, CAT）修饰的T细胞，通过在T细胞表 面表达CD3-ζ链和CD27、CD28、41BB或OX40共刺激信号，使T细胞活化，针对表达GD2、HER2、IL11Rα或FAP等TAA的肿瘤高效杀伤。目前研究最为充分的是以Her-2为CAT修饰的T细胞。Ahmed进行了HER2-CAR T细胞骨软组织肉瘤Ⅰ/Ⅱ期临床研究，入组19例HER2阳性肿瘤（16例骨肉瘤，1例Ewing肉瘤，1例原始神经外胚层肿瘤，1例结缔组织增生性小圆细胞瘤），患者的中位总生存期为10.3个月，其中4位患者病情稳定在12周至14个月。
表11—14 骨肉瘤表达的肿瘤相关抗原
注：CLUAP1：糖蛋白聚核素相关蛋白1，FAP：成纤维细胞激活蛋白，GAGE：黑色素瘤抗原，GD2：双唾液酸神经节苷酯，HER2：人上皮生长因子受体2，
IL11Rα：白介素11受体α，MAGE：黑色素瘤相关抗原，MCAM：黑色素瘤细胞黏附分子，NY-ESO-1：纽约食管鳞状上皮细胞癌1，TEM1：肿瘤内皮细胞标记物1。
表11—15 骨肉瘤T细胞治疗的基因修饰(https://www.daowen.com)
注：DN：显性失活，HSV-tk：单纯性疱疹胸腺嘧啶激酶，IL：白介素，TGFβ：转化生长因子β。
二、 NK细胞在骨肉瘤中的应用
NK细胞是除T细胞和B细胞之外的第三类淋巴细胞，是体内自然免疫的第一道防线。它既是重要的外向性自然防御细胞，又是体内多种免疫细胞的调节细胞，在机体固有免疫及过继免疫治疗中发挥着重要作用。骨肉瘤患者外周血NK细胞数目低于正常人，且骨肉瘤细胞表面HLA类抗原表达下调，循环中的骨肉瘤细胞更是因为缺乏黏附分子表达CD54和CD58，从而逃避了NK细胞的杀伤。通过抗体增强ADCC介导的NK细胞杀伤效应，是骨肉瘤免疫治疗的一个方向。90%以上骨肉瘤细胞表达EGFR，NK细胞对EGFR阳性细胞效率高于阴性细胞。IL-2作为免疫治疗的关键因子，可以上调骨肉瘤患者NK细胞数，同时还可以活化NK细胞，增强其颗粒素释放能力。Guma研究显示气雾剂IL-2可显著增加NK细胞聚集于肺部，予裸鼠骨肉瘤肺转移模型气溶胶IL-2或气雾剂PBS处理，发现气雾剂的IL-2没有增加在脾脏和肝脏NK细胞的增殖，但气雾剂或气溶胶IL-2显著加了NK细胞在肺部的聚集，且该组骨肉瘤肺转移裸鼠的整体存活率远高于对照组。神经节苷脂GD2是在人类癌症和干细胞广谱发现的肿瘤相关表面抗原，在骨软组织肿瘤如骨肉瘤、Ewing肉瘤、横纹肌肉瘤均高表达。GD2已经被证明是安全的抗体靶向，神经母细胞瘤患者应用抗GD2的抗体后，NK细胞CD16表达上调活化，目前其在骨软组织肉瘤的治疗尚在探索阶段。
三、 抗原提呈细胞在骨肉瘤中的应用
树突细胞（dendritic cell）也称DC细胞，是一种既具分支或树突状形态及吞噬功能，又能提呈抗原的细胞。树突细胞在外周组织像“哨兵”一样，处于非成熟状态，但具有极强的抗原内吞和加工处理能力。在它摄取抗原或受到某些因素刺激后，可以分化成熟，同时发生迁移，由外周组织通过淋巴管和血液循环进入次级淋巴器官，然后激发T细胞应答。树突细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的树突细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给患者，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。2014年路易斯维尔大学发表一项Ⅰ期临床报道，自体树突状细胞负载MAGE-A1、MAGE-A3和NY-ESO-1肽疫苗治疗15例复发/难治性肿瘤，包括神经母细胞瘤、Ewing肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤，其中1例患者达到完全缓解并维持2年。该报道虽然样本例数少，但仍给予骨软组织肉瘤治疗带来希望，有待进一步临床样本扩大验证。
四、 其他免疫治疗在骨肉瘤中的应用
卡介苗（bacille calmette-guerin, BCG）作为抗肿瘤免疫刺激剂已被使用了几十年。早期的BCG主要成分为是卡介苗细胞壁的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide, MDP）。而保留了大部分天然卡介苗免疫刺激性的胞壁酰三肽（muramyl tripeptide, MTP）显著提高了其脂溶性。经过加工改造的脂质体胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺（liposomal muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine, L-MTP-PE）或称其为米法莫肽（mifamurtide）则更具优势，其在骨肉瘤治疗中展现出优异的效果。米法莫肽是一种非特异性免疫调节剂，与巨噬细胞或单核细胞内的Nod2结合，通过NF-κB途径激活巨噬细胞和单核细胞，诱导非特异性免疫应答杀伤骨肉瘤细胞（图11-6）。2014年得克萨斯大学MD安德森癌症中心报道，该中心从2008年到2012年，给予205名转移性和复发骨肉瘤患者米法莫肽治疗，146位患者病情得到有效控制（71%）。米法莫肽的血清浓度在第30分钟输注后迅速下降，t1/2为2小时，主要不良反应是寒战、高热，或头痛、疲劳症状群，极少数为3级或4级。该项研究1年和2年总生存率分别为71.7%和45.9%。
骨软组织肉瘤是一大类异质性非常大的肿瘤，同一患者肿瘤组织内可有不同性质的瘤细胞混杂，远处转移发生早、比例高，转移患者3年生存率目前仍徘徊在15%～30%。这类患者往往接受过多次大剂量化疗和放疗，对各种治疗的耐受性差，而免疫治疗的不良反应轻，3～4级发生率在10%左右，具有较好的应用前景。上述的一些免疫治疗方案在骨软组织肉瘤治疗中初显成效，但均在Ⅰ～Ⅲ期临床试验过程中，其安全性和耐受性均需要进一步扩大样本验证，有望使骨软组织肿瘤患者长期带瘤生存的梦想得以实现。
图11-6 作用机制