附 病理诊断及检验技术的临床应用
附 病理诊断及检验技术的临床应用
虽然随着医学科学的发展，对疾病的诊断手段日益增多，但是迄今即使世界上医学科技最发达的国家对疾病时人体的形态学变化的确诊依然要通过病理诊断。在国外，病理诊断作为最终诊断被称为各类诊断中的“金标准”。我国各种疾病发病情况及死亡回顾统计中都将病理诊断作为第一诊断。因此，病理诊断是医院医疗诊断服务工作的中心环节，其水平直接关系着医院的诊治水平，故一个医院病理诊断水平是该医院医疗质量主要指标之一。临床病理工作几乎面向所有临床科室，因此病理诊断医师必须具备广泛的临床知识及深厚的病理知识才能作出准确的诊断，从而促进临床医疗水平的提高，更好地为广大患者服务。
一、临床病理诊断的主要内容和方法
（一）常用的活检种类及方法
1.钳取活检 是目前临床最常用、最简单的取材方法之一，适用于皮肤、口唇、口腔黏膜、鼻咽、宫颈等处，也可通过内镜检查钳取食管、胃、泌尿道等处组织。钳取组织多为体表或腔道黏膜组织的表浅肿瘤，特别是外生性或溃疡性肿瘤。钳取活检前，首先要观察肿瘤的大体情况及周围组织关系，对外生性肿瘤要取较深部位，对溃疡性肿瘤要求钳取溃疡组织。这既可避免变性坏死的瘤组织难以诊断，又可看到瘤组织与正常组织关系，利于诊断。组织质脆容易钳取常为恶性，组织坚韧难取常为良性。钳取组织时动作要轻，避免组织挤压以致诊断困难。
2.切取活检 从肿瘤组织上直接切取小组织是目前常用的活检方法之一。它常用于肿瘤较深较大未破溃者，也适用于开胸或开腹探查采取组织。此法优点是取材部位准确，组织损伤较小，容易得到比较满意的诊断。
3.切除活检 此法适用于较小或位置表浅肿瘤，要将肿瘤全部切除，既达到活检目的，也是一种治疗手段，如较小的皮肤肿瘤等。在切除活检前，临床医生要先对肿瘤性质初步估计，如考虑恶性应切除范围大一些。对于淋巴结的活检，要将淋巴结全部摘除送检，且最好采取颈部、腋窝或腹股沟淋巴结。
4.针吸活检 用针吸方法采取活体组织称针吸活检，适于皮下软组织或内脏实质性肿块。近几年，国际上流行一种细针细胞学检查，对于肿瘤的组织学诊断又多了一种有效手段。
5.痰液及胸、腹水检查 首先将液体离心沉淀，用95%乙醇固定沉淀物，然后脱水、包埋、制片。
6.冷冻切片 是指在手术过程中即时采取组织，在低温冷冻条件下迅速制片并进行诊断的方法。它有利于术中及时确定病变性质、决定手术范围，同时也可确定肿瘤边缘是否切除干净、淋巴结有否转移等，为临床医生术中决策提供依据。由于冷冻切片诊断相对困难且责任重大，病理医生诊断时十分慎重，无绝对把握不轻易下结论。
7.标本印片或涂片 术中印片或涂片也是一种快速诊断方法。一般可解决肿瘤良、恶性问题，但由于只能见到瘤细胞，不能查见瘤组织结构，故效果较差。
（二）送检标本肉眼检查与取材
送检标本的肉眼检查及取材是临床病理诊断工作中最重要的环节之一，诊断医师必须参与此工作，否则易因标本肉眼检查或取材不当而发生漏诊或误诊。
标本送检后应及时固定，常用固定液主要有甲醛、乙醇、醋酸及戍二醛等，临床上常用10%甲醛溶液作为固定液，效果较好可防止组织腐败自溶；在特定条件下可用80%乙醇固定小标本或组织涂片；醋酸穿透性好，常和其他固定液混含使用；戍二醛固定通常用于电子显微镜检查。标本送检还应严格查对并及时登记编号，防止差错事故发生。
标本检查及描述应根据由表及里、由上到下、由前往后、由大至小的原则逐一检查描述。一般非肿瘤标本须检查大小、色泽、形状、质地、结构及数目、表面有否渗出，以及病变部位的特征等。肿瘤标本则应检查确切部位、大小、形态、色泽、包膜情况及其质地与周围组织关系等。囊性标本则应检查大小、囊壁厚度、囊内壁状况以及内容物的性质。在制作标本切面时，原则上暴露最大病变或肿块面积，同时保存与邻近组织关系；要求一刀切开保持切面平整，尽量避开坏死组织，选取典型部位的组织，某些情况下可作多个平行切面观察取材。所取组织块长度和宽度不宜超过2cm，厚度不宜超过0.3cm，同时附上标记号码以便核对。取材工作通常由二人配合，一人检查取材，另一人负责记录。取材完毕后送交病理技术室由专业病理技术员进行脱水、包埋、切片等技术处理，最后制成合格病理切片供诊断医师使用。
（三）病理诊断报告的基本格式
病理诊断医师通过肉眼检查以及在显微镜下通过组织切片的观察，最后得出相应诊断结果并写出诊断报告供临床医生参考，了解病理诊断报告的基本格式是很有必要的。通常病理诊断报告格式有这样几种：
1.确性诊断 报告形式为病变部位+诊断结论；如送检标本为右侧乳腺肿块，报告为（右侧乳腺）纤维腺瘤。
2.诊断 在常规检查手段难以分类确诊时，常用推论性诊断。报告形式为考虑是某病变，但某种疾病待排除，建议进一步做某种检查以确诊；例如鼻咽恶性肿瘤，考虑为未分化癌，恶性淋巴瘤待排，建议免疫组化确诊。
3.描述性诊断 有时疾病及病变性质根据送检材料难于确诊时，可将镜下所见描述出来，作为报告。此种情况常常是由于送检物过小或临床医生取材不当所致。
4.形态描述加诊断结论 近年来国外较常采用此种形式，有利于临床了解病理变化特点，对疾病认识更加深刻，从而掌握某种疾病变化规律，以利于临床治疗。例如病变为左甲状腺肿瘤，检查后报告为镜下见癌细胞被覆纤维血管轴形成乳头状结构，乳头细长且分支较多，被覆乳头的癌细胞是立方形或低柱状的，细胞质淡染，胞核较正常为大，呈毛玻璃样重叠排列，可见核沟及核内包涵体，散在砂粒体形成。综上所述，诊断为：（左甲状腺）乳头状癌。
5.病变性质报告 根据送检材料作确切诊断，有困难时常发此类报告，报告主要是将病变性质写出供临床医生参考；如送检组织为穿刺淋巴结组织，可见肉芽肿结构但又不典型，则报告为淋巴结肉芽肿性炎，可能为结核。
临床工作中，一般检查的标本病理报告应在收到标本后3天内发出，特殊情况可延至1周。如因故不能按时发出报告应说明延迟原因，及时与临床医生联系并共同处理。
（四）临床病理诊断中的注意事项
首先是活检标本的取材，成功的取材是正确而及时的病理诊断的保证。应遵守以下几个原则：①取材要取最可疑的病灶，而且多发性病变要分别取材，即不仅要取最早出现的病灶，还要取新近比较明显的病灶；②应在病变与正常组织的交界处取材；③要避开坏死或明显继发感染区；④不要沿病灶做水平切取，而应垂直切取，有一定的深度，胃肠黏膜活检应包括黏膜肌层；⑤活检取材应避免挤压或用无齿镊夹取；⑥大的标本宜对解剖位置标志；⑦淋巴结活检应切除完整的淋巴结送检。视检查目的不同而选取不同部位的淋巴结；若了解转移情况应取引流区域淋巴结；若怀疑淋巴瘤则应首选颈部淋巴结，并且深部者较浅表好，除非下肢恶性肿瘤一般不取腹股沟淋巴结。
其次临床医生要认真填写病理申请单。在许多情况下，缺乏临床资料的病理医生是不可能作出明确诊断的；单凭镜下所见而不结合临床资料作出的病理诊断出现误诊、漏诊的可能性很大。而一份完整、详细的申请单是病理医生所能掌握的第一手临床资料。多年实践证明，许多疾病特别是一些肿瘤性疾病有其好发年龄和好发部位，如母细胞瘤好发于儿童；脂肪源性肿瘤发生于体表则多为良性，而发生在体内深部则恶性可能大。因此，在诊断时容易将思路缩小到一个恰当范围。同样，病理摘要可为病理医生诊断提供重要参考。写明病史，使病理形态更能与临床相结合，则有利于作出合乎客观规律的诊断。
临床医生应掌握一些病理知识，这对正确理解病理诊断是至关重要的。例如，很多肿瘤有一些交界性病变，如卵巢潜在恶性的乳头状囊腺瘤，它与一般的囊腺癌在治疗方法及生物学行为方面是不同的，如果将两者等同，同样处理，将会给患者带来一些严重的不良后果。又如，纤维组织细胞瘤，是新近较重视的一种软组织肿瘤，了解其性质、范围就会给予恰当治疗。另外，不同描述方式有着不同概念，如“癌，可能为鳞状细胞癌”与“鳞状细胞癌”的诊断含义完全不同。临床医生还必须了解病理诊断条件，如组织不能过小、不能过度挤压、要采取完好的病变组织等。另外病理学诊断也有其局限性，这一点临床医生应当了解并向患者和家属做解释。由于取材少或者不具有代表性，有时病理报告中会有“疑为”等不肯定的词句，有时会建议再作活检，如鼻咽癌的诊断有时会作2～3次活检才取到有代表性的组织。因此，临床医生具有一定病理知识对做好临床工作是非常重要的。(https://www.daowen.com)
二、常用临床病理检测技术
（一）常规石蜡切片HE染色技术简介
临床病理工作中最常用的病理制片技术为石蜡包埋组织切片，HE染色（苏木精-伊红染色）制片。操作步骤大致如下：
1.取材 根据病变组织大小，用锋利刀剪取材，并尽快投入固定液中避免挤压组织。
2.固定 取材完毕后，所取组织块按顺序加以标签置于脱水篮中，首先进行固定，常用10%甲醛溶液或专用固定液固定，需2～3小时；充分固定后置入酒精中进行梯度脱水。
3.脱水 是将组织块置于酒精缸中，酒精浓度由低至高将组织块中水分充分去除，约需10小时。
4.透明 脱水之后置入二甲苯中透明，需1～2小时。
5.浸蜡 透明过后组织块置入溶化的石蜡中2～3次，每次约1小时，称为浸蜡。
6.包埋 然后将组织块一一取出，分别放入包理框利用手工或自动包埋机封入蜡液中，凝固后制成组织蜡块可长久保存。
7.切片 蜡块制作完成后利用专门的病理组织切片机进行切片，厚度通常为2～3μm，切下的切片先放入50%乙醇中，再用玻片将其捞入45℃左右温水中，使其展于水面上；选择最平整无破碎切片贴附于载玻片上，贴附后置于60℃温箱内烘干以备染色。染色前经过二甲苯脱蜡，乙醇及水洗后置入苏木精染液中数分钟；水洗后进行盐酸分化，再置入伊红溶液中复染数分钟，使切片上组织着色，再水洗；最后切片再经过脱水、透明、封固等步骤制成HE切片；染色后结果为：胞核呈紫蓝色、胞质呈淡红，对比鲜明、结构清晰。
（二）临床病理诊断中的常用技术
在日常病理诊断工作中约85%的病理标本能通过常规石蜡切片作出准确诊断，但由于种种原因，尚有15%的病例单纯依靠苏木精-伊红染色难于确定其确切组织来源，这就需要新的检测技术克服这一问题。近年来，随着电子显微镜、免疫组织化学在临床病理学上的应用，极大地推动了诊断病理的发展，解决了许多诊断难题，对许多疾病有了更新更深刻的认识。如免疫组织化学技术、电子显微镜技术、肿瘤的细胞动力学及DNA分析等。
1.免疫组织化学技术 在20世纪70年代出现，90年代中后期开始广泛应用于临床诊断中；现已成为病理医生进行病理诊断特别是疑难诊断时不可缺少的重要工具。同时，免疫组织化学技术的应用把古老的细胞形态学提高到一个新的水平，使形态和功能密切结合，对许多疾病的诊断及研究产生了巨大影响。
（1）免疫组织学技术原理：免疫组织化学是利用抗原抗体结合反应的原理，在组织制片以针对某种物质的抗体进行结合反应，然后以适当的方式显示其结合信号，以证明其存在的技术。
（2）抗体和标记物：抗体主要有两大类，即多克隆抗体、单克隆抗体。多克隆抗体即针对多个抗原决定簇的抗体，为产生抗体动物（如兔、马等）的血清或免疫球蛋白或某一免疫球蛋白的成分。单克隆抗体为一个B细胞分化增殖的抗体，可识别有限的抗原决定簇，组成均匀、特异性强。标记物显示抗原抗体结合反应依赖于特定的显示物，主要有：
1）酶标反应：主要有碱性磷酸酶和辣根过氧化酶。
2）免疫荧光：通过荧光素标记抗体，借助荧光显微镜观察荧光的发光物质。
常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光黄，发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光；四甲基异硫氧酸罗达明，发射光谱为620nm，呈橙红色荧光；四乙基罗达明，呈橙红色荧光，发射光谱为590～600nm。
（3）主要方法：免疫组织化学的基本方法是将特异抗体与切片反应，然后根据标记物的要求以适当方法显示（如酶反应显色，荧光激发、胶体金显示）。但由于实际适用的需要带有多种改进以增进特异性和敏感性。主要方法有：①直接法，特点为将带有标记的抗体直接与抗原反应，然后检出。②间接法，即将针对抗原的第一抗体反应后以其抗体（第二抗体）结合，再检出。特点是经过第二抗体放大效应。③ABC法，生物素和卵白素为具有高度亲和性的物质，一个卵白素分子可结合4个生物素，当将生物素标上特定的标记物质后或与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物（和HRP、AP等荧光素）的生物素的结合物反应，再以适当方法显示。④PAP法，即以过氧化酶和抗过氧化物抗体形成的复合物通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酌底物反应检出。这可大大提高检测的敏感性。
（4）免疫组织化学技术在诊断病理方面的应用
1）病毒性感染疾病的诊断：有人乳头状病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、EB病毒、艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）的诊断。
2）肿瘤的鉴别诊断：①上皮性肿瘤标记：角蛋白、上皮膜蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原。②间叶组织肿瘤标记：波形蛋白、结蛋白、纤维连接蛋白。③神经源性肿瘤标志：胶质纤维酸性蛋白、突触囊泡蛋白。④内分泌肿瘤标志：脑垂体：生长激素、催乳素；胰岛细胞肿瘤：胰高血糖素、胰岛素、胃泌素等，甲状腺和甲状旁腺肿瘤：降钙素，S—HT等。⑤淋巴瘤免疫标志：免疫球蛋白、白细胞抗原。⑥增殖细胞核抗原：DNA多聚酶及酶。⑦激素受体：雌激素（ER）、孕激素（PR）。⑧癌基因蛋白。
2.电子显微镜 电子显微镜有数种类型，如透射电镜、扫描电镜、超高压电镜、分析电镜以及隧道扫描电镜。一般诊断病理常用透射电镜。主要特点：分辨率高、观察面积局限。
电镜样本的处理及制作，其标本制作也是通过取材、固定、脱水、浸泡及包埋、修整、染色等操作步骤完成的。电镜观察可以看到细胞核、细胞器、细胞表面及细胞连接等分子结构。
电镜技术的应用很广泛，在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的研究和观察，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点；在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定；最早关于细胞凋亡的形态学描述也是源于电镜的观察。当然电镜技术也有其局限性，有时还可能出现遗漏信息。当用于辅助肿瘤外检诊断时，只能判定组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良、恶性质。