LRP5功能缺失小鼠模型的建立

为得到靶向载体，Masaki等［8］将含有LRP5外显子6-8的基因组克隆从小鼠129/SV的基因组文库中分离。并构建出替代载体：将PGK-Neo盒和IRES-半乳糖苷酶基因插入到外显子6的SphI位点，线性载体电转入胚胎干 (ES)　(R1)细胞，在经过G418和FIAU双重选择后，采用5'和3'侧翼探针，将LRP5针对性的ES细胞经Southern blot杂交鉴定克隆。将携带正确突变位点的ES细胞注射到C57BL/6J囊胚。产生的雄性嵌合体与C57BL/6J雌性小鼠交配，子代小鼠通过Southern印迹鉴定。根据标准程序用5μg poly-A+RNA或1～10μg总RNA进行Northern blot实验。将从LRP5的cDNA上PstI和BamHI酶切位点两端剪切消化下来的401-bp片段用作5'探针，该片段位于LRP5开放阅读框上核苷酸位点71(外显子1)和471(外显子2)之间。将从LRP5的cDNA 上BamHI和PstI酶切位点两端剪切下来520 bp片段作为3'探针，该片段位于LRP5开放阅读框上核苷酸位点2301(外显子10)和2821(外显子12)之间。