BMPRl B基因敲除小鼠的构建

Yi等［17］将BMPRl B克隆从129/SV小鼠基因组DNAλphage文库中分离。目标载体的构建是在PGK启动子的控制下，用新霉素抗性基因取代内显子1中含有起始蛋氨酸一个2.8kb的HindIIIBgl II片段生成，即PGKneopA。在新霉素盒下游4.4kb位置放入一个MC1胸苷激酶盒(MC1tkpA)，质粒序列经SalI剪切，目标载体经电转转入胚胎干细胞，筛选出的克隆注入小鼠囊胚。嵌合小鼠与C57BL/6J雌性小鼠交配，子代经Southern杂交分析。同时嵌合体也与129/SV雌性小鼠交配，129/SV与C57BL/6J小鼠表型是相同的。BMPRl B-/-小鼠经XbaI消化基因组的DNA用Southern印迹分析鉴定基因型。外显子1的缺失使用新生幼鼠或成年小鼠脑RNA用RT-PCR确认。5'非翻译外显子和外显子2内的引物为：5'-GGC TGA ATC ACA ACC ATT TGG-3'；5'-GGG TGG AGG TCT TTA TTA CAC-3'。外显子1起始到跨越外显子4引物为：5'-ATG TGGGCA CCA AGA AGG AGG AT 3′AND 5′AGGGAC TCTCCA GGA GGA ATGAT-3'。正确的克隆会产生缺乏外显子1等位基因，Southern印迹分析没有检测到外显子1的扩增产物。(https://www.daowen.com)

将GDF5bp-J-/-小鼠与BMPRl B基因敲除小鼠交配，得到BMPRl B；GDF5bp-J双敲除杂合小鼠。