Sost基因敲除小鼠模型的建立

Li等［20］从129/SvJxi系小鼠基因组BAC文库克隆含有两个外显子的骨硬化基因 (Sost)并将其作为正负选择替换型目标载体的PCR模板。外显子1和外显子2编码区分别为214bp及422bp长。其间内含子为2.5kb。同源短臂为2.3kb，其3'末端包含ATG起始位点及40个外显子1编码的额外氨基酸：Forward primer，5'-ATTTGGCGCGCCCACGAGCCATCCTGTGAAAAG-3'；Reverse primer，5'-ACGTGCGATCGCGCACAAGTAGGCAGATGAGGC-3'；使用AscI和SgfI亚克隆。同源长臂为6.2kb，其5，末端为外显子2的编码区21个氨基酸，并包含 TAG终止位点 (Forward primer，5'-ATTGGCCGGCCGATATCGAGCTGGAGAACGCCTACTA-3'；Reverse primer，5'-CGTAAGTGCGGGTCGACGCAGCTGGTACTCAGTCAGT-3')；用FseI位和Sal亚克隆。将EcoRV位点连接在长臂邻近FseI位点上生成EcoRV多态性用于Southern印迹鉴定目标胚胎干 (ES)细胞克隆。最终目标载体含有2.3kb的短臂，6.2kb的长臂，一个新霉素抗性基因，用于采用G418表达盒做正向选择；两个串联拷贝 (单纯疱疹病毒胸苷激酶基因)用于采用FIAU表达盒做负向选择。该新霉素表达盒 (PGKneo PGK启动子和PGK聚腺苷酸信号/终止子)通过两侧loxP位点，在loxP位点外侧邻近PGK启动子的位置为双向的SV40聚A信号/终止子的三重重复序列，用于目标基因的转录终止。伴有有新霉素表达盒的插入和侧翼序列的SOST靶向序列导致90%以上的骨硬化素编码区和2.5-kb的内含子的缺失。GS-1(129/SVJ株)的ES细胞与线性化的目标载体经电转转入囊胚。这些众多的靶向ES细胞克隆通过短臂侧别经PCR筛选。采用定位于长臂3端0.8kb处的285bp探针进行Southern blot分析经EcoRV酶切的胚胎干细胞DNA，来确定长臂上正确的目标位点。该外部探针经 PCR得到 Forward primer，5'-CCTCCAGAACTCAGAGCCAAAT-3'；Reverse primer，5'-TCTTGTTACCCCAGACCCTCAT-3'。正确地靶向ES细胞注射到C57BL/6胚泡得到杂合小鼠，该子代小鼠与瑞士黑小鼠交配得到杂合的Sost转基因小鼠。