液体菌种生产的要点
1.液体菌种生产环境
（1）生产场所 液体菌种生产场所应距工矿业的“三废”及微生物、烟尘和粉尘等污染源500m以上。交通方便，水源和电源充足，有硬质路面、排水良好的道路。
（2）液体菌种生产车间 地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑、易清洗，应有1.0%～1.5%的排水坡度和良好的排水系统，排水沟必须是圆弧式的明沟。墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。
（3）液体菌种接种间 应设置缓冲间，设置与职工人数相适应的更衣室。车间入口处设置洗手、消毒和干手设施。接种车间设封闭式废物桶，安装排气管道或者排风设备，门窗应设置防蚊蝇纱网。
2.生产设施设备
（1）生产设施 配料间、发菌间、冷却间、接种间、培养室、检测室规模要配套，布局合理，要有调温设施。
（2）生产设备 液体菌种培养器（图2-28、图2-29）、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、超净工作台、接种箱、恒温摇床、恒温培养箱、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、酸度计等。
其中液体菌种培养器、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应使用经政府有关部门检验合格，符合国家压力容器标准的产品。
3.液体培养基制作
（1）罐体夹层加水 首先对液体菌种培养器夹层加水，方法是用硅胶软管连接水管和罐体下部的加水口，同时打开夹层放水阀进行加水，水量加至放水阀开始出水即可。
（2）液体培养基配方 液体菌种培养基配方（120L）：玉米粉0.75kg，豆粉0.5kg，均过80目筛。首先用温水把玉米粉、豆粉搅拌均匀，不能有结块，通过吸管或漏斗加入罐体，液体量以占罐体容量的80%为宜。然后加入20mL消泡剂，最后拧紧接种口螺丝。
图2-28 液体菌种培养器示意图
图2-29 液体菌种培养器剖面图
（3）液体培养基灭菌 调整控温箱温度至125℃，打开罐体加热棒开始对罐体进行加热，在100℃之前一直开启罐体夹层出水阀，以放掉夹层里的虚压和多余的水。
1）液体培养基气动搅拌：温度在70℃以下时打开空气压缩机，通过其储气罐和空气过滤器对罐体培养基进行气动搅拌，防止液体结块。
开气泵搅拌的步骤为：打开空气过滤器上方的进气阀、出气阀和下方的出气阀，开气泵电源后，关闭空气过滤器下方的出气阀，打开罐体最下方的罐体进气阀和最上方的罐体放气阀。
2）关闭气泵：当罐体内培养基达70℃时，关闭气泵。方法是先关闭罐底进气阀、开空气过滤器下方的放气阀、关闭气泵电源。把主管接到之前一直关闭的空气过滤器出气阀，此时将空气过滤器放气阀、进气阀、出气阀全关闭。空气过滤器内可加入少量水，水位在滤芯以下，并关闭罐体放气阀。
3）灭菌：当夹层出水阀出热蒸汽3～5min后关闭。当夹层压力表达0.05MPa时，打开空气过滤器夹层出气阀，再打开罐体进气阀，然后小开罐体放气阀。当主管烫手后，关闭罐体放气阀。当罐体压力表达到0.15MPa开始计时，保持30～40min，保持压力期间可以温调压。
4）降温：调温至25℃，关闭加热棒、罐底进气阀、空气过滤器夹层出气阀。用燃烧的酒精棉球烧空气过滤器出气阀40～50s，在此期间可小开5～6s空气过滤器出气阀，放蒸汽。在酒精棉球火焰的保护下把主管接回空气过滤器出气阀（图2-30）。
5）放夹层热水：打开空气过滤器出气阀和空气过滤器进气阀，小开罐体放气阀，通过夹层进水阀把夹层热水放掉，直至夹层压力表压力为0MPa。
（4）冷却 打开夹层出水阀，夹层进水阀通过硅胶软管接入水管，进行冷却。当罐体压力表压力降至0.05MPa时，打开气泵以防止罐体在冷却过程中产生负压造成污染，并使下部冷水向上冷却较快。
开气泵顺序依次为：打开空气过滤器下部放气阀，开空气过滤器上方出气阀，开气泵、关空气过滤器放气阀、开罐体进气阀，通过罐体放气阀调节罐体压力在0MPa以上直至罐体温度降至28℃以下，等待接种。
4.接种
（1）固体专用种 液体菌种的固体专用种培养基配方一般为（120L）：过40目筛的木屑500g、麸皮100g、石膏10g，料水比1∶1.2。原料混合均匀后装入500mL三角瓶内，高压灭菌后接入母种，洁净环境培养至菌丝长满培养基（图2-31）。
图2-30 主管接空气过滤器出气阀
图2-31 固体专用种
（2）制备无菌水 1000mL的三角瓶加入500～600mL的自来水，用手提式高压灭菌锅在121℃、0.12MPa条件下保持30min即可制备无菌水。冷却后等待把固体专用种接入。
（3）固体专用种并瓶(https://www.daowen.com)
1）接种用具：酒精灯、75%酒精、尖嘴镊子、接种工具、棉球。
2）消毒：旋转固体专用种的三角瓶壁用酒精灯火焰均匀地进行消毒后，连同接种工具、无菌水放入接种箱或超净工作台中进行消毒。
3）接种：消毒20min后进行接种。用75%酒精棉球擦手，用酒精灯火焰对接种工具进行灼烧灭菌。用灭菌后的接种工具在酒精灯火焰保护下去掉三角瓶固体专用种的表层部分。把菌种中下部分搅碎后在酒精灯火焰保护下分3～4次加入无菌水中（图2-32），然后用手腕摇动三角瓶使菌种和无菌水充分接触，静置10min后接入罐体。
（4）菌种接入罐体
1）制作火焰圈：用带有手柄的内径略大于接种口的铁丝圈缠绕纱布，蘸上95%酒精。
2）接种：打开罐体放气阀使压力降至0MPa，把火焰圈套在接种口上，点燃火焰圈后关闭放气阀。打开接种口，然后快、稳、轻地接入菌种，然后拧紧接种口的螺丝（图2-33）。
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图2-32 固体专用种并瓶
图2-33 菌种接入罐体
5.液体菌种培养
通过气泵充气和调整放气阀调节罐体压力表压力在0.02～0.03MPa、温度控制在24～26℃等条件下进行液体菌种培养。液体菌种在上述条件下培养5～6天可达到培养指标（图2-34）。
6.液体菌种检测
接种后第四天进行检测，首先用酒精火焰球灼烧取样阀30～40s后，弃掉最初流出的少量液体菌种，然后用酒精火焰封口直接放入经灭菌的三角瓶中，塞紧棉塞，取样后用酒精火焰把取样阀烧干，以免杂菌进入造成污染。
图2-34 培养中的液体菌种
将样品带入接种箱分别接入到试管斜面或培养皿的培养基上，放入28℃恒温培养2～5天，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况和有无杂菌污染。若无细菌、真菌等杂菌菌落生长，则表明该样品无杂菌污染。
【窍门】
由于有的单位条件有限，可采取感官检验——“看、旋、嗅”的步骤进行检测。
1）“看”：将样品静置桌面上观察，一看菌液颜色和透明度，正常发酵的料液清澈透明，染菌的料液则浑浊不透明；二看菌丝形态和大小，正常的菌丝体大小一致，菌丝粗壮，线条分明，而染菌后，菌丝纤细，轮廓不清；三看pH指示剂是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指示剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH到4.0左右，为发酵终点，如24h内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变；四看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处有灰条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。
2）“旋”：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。菌丝的悬浮力好，放置5min后不沉淀，说明菌丝活力好。若迅速漂浮或沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再观若其菌丝形态、大小不一，毛刺明显，表明供氧不足。如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。
3）“嗅”：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味，培养好的优质液体菌种均有芳香气味，而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种气味。污染杂菌的主要原因是菌种不纯、培养料灭菌不彻底、并瓶与接种操作不规范。
7.优质液体菌种指标
（1）感官指标 感官指标见表2-1。
表2-1 液体菌种感官指标
（续）
（2）理化指标 理化指标见表2-2。
表2-2 液体菌种理化指标
