原种、栽培种制作，使用中的异常情况及原因分析
1.接种物萌发不正常
原种、栽培种接种物萌发不正常的主要表现有两种情况：一是不萌发或萌发缓慢；二是萌发出的菌丝纤细无力，扩展缓慢。其发生原因的分析思路：培养温度→培养基含水量→培养基原料质量→灭菌过程及效果→母种。对于接种物不萌发，或萌发缓慢，或扩展缓慢来说，这几个方面的因素必有其一，甚至可能是多因子共同影响。
（1）培养温度过高 培养温度过高会造成接种物不萌发、萌发迟缓、生长迟缓。
（2）含水量过低 尽管拌料时加水量充足，但由于拌料不均匀，造成培养基含水量的差异。含水量过低的菌种瓶（袋）接种物常干枯而死。
（3）培养基原料霉变 正处霉变期的原料中含有大量有害物质，这些物质耐热性极强，在高温下不易分解变性，甚至在高压高温灭菌后仍保留其毒性，接种后，菌种不萌发。具体确定方法是将培养基和接种块取出，分别置于PDA培养基斜面上，于适宜温度下培养，若不见任何杂菌长出，而接种块则萌发、生长，即可确定为这一因素。
（4）灭菌不彻底 培养基内留有大量细菌，而不是真菌。多数情况下无肉眼可见的菌落，有时在含水量过大的瓶（袋）壁上，在培养基的颗粒间可见到灰白色的菌膜。多数食用菌在有细菌存在的基质中不能萌发和正常生长。具体检查方法是在无菌条件下取出菌种和培养料，接种于PDA培养基斜面上，于适温条件下培养，经24～28h后检查，在接种物和培养料周围都有细菌菌落长出。
（5）母种菌龄过长 菌种生产者应使用菌龄适当的母种，多种食用菌母种使用最佳菌龄都在长满斜面后1～5天，栽培种生产使用原种的最佳菌龄在长满瓶（袋）14天之内。在计划周密的情况下，母种和原种生产、原种和栽培种的生产紧密衔接是完全可行的。若母种长满斜面后一周内不能使用，要及早置于4～6℃下保存。
2.发菌不良
原种、栽培种的发菌不良有生长缓慢，生长过快但菌丝纤细稀疏，生长不均匀，菌丝不饱满，色泽灰暗等。造成发菌不良的原因主要有以下几个方面：
（1）培养基酸碱度不适 用于制作原种、栽培种的培养料若pH过高或过低，可将发菌不良的菌种瓶（袋）的培养基挖出，用pH试纸测试。
（2）原料中混有有害物质 多数食用菌原种、栽培种培养基原料主料是阔叶木屑、棉籽壳、玉米粉、豆秸粉等，但若混有如松、杉、柏、樟、桉等树种的木屑或原料有过霉变，都会影响菌种的发菌。
（3）灭菌不彻底 培养基中有肉眼看不见的细菌，会严重影响食用菌菌种菌丝的生长。有的食用菌虽然培养料中残存有细菌，但仍能生长。如平菇菌种外观异常，表现为菌丝纤细稀疏、干瘪不饱满、色泽灰暗，长满基质后菌丝逐渐变得浓密，如果不慎将后期菌丝变浓密的菌种用来扩大栽培种将导致大批量的污染发生。
（4）水分含量不当 培养料水分含量过多或过少都会导致发菌不良，特别是含水量过大时，培养料氧气含量显著减少，将严重影响菌种的生长。在这种情况下，往往长至瓶（袋）中下部后，菌丝生长变缓，甚至不再生长。
（5）培养室环境不适 培养室温度、空气相对湿度过高，培养密度大的情况下，环境的空气流通交换不够，影响菌种氧气的供给，导致菌种缺氧，生长受阻。这种情况下，菌种外观色泽灰暗、干瘪无力。
3.杂菌污染
在正常情况下，原种、栽培种或栽培袋的污染率在5%以下，各个环节和操作规范者，常只有1%～2%。如果超出这一范围，则应该认真查找原因并采取相应措施予以控制。
（1）灭菌不彻底 灭菌不彻底导致污染发生的特点是污染率高、发生早，污染出现的部位不规则，培养物的上、中、下各部均出现杂菌。这种污染常在培养3～5天后即可出现。影响灭菌效果的因素主要有以下几个：
1）培养基的原料性质：常用的培养基灭菌时间关系是木屑＜草料＜木塞＜粪草＜谷粒。从培养基原料的营养成分上说，糖、脂肪和蛋白质含量越高，传热性越差，其对微生物有一定的保护作用，灭菌时间相对要长。因此添加麦麸、米糠较多的培养基所需灭菌时间长。从培养基的自然微生物基数上看，微生物基数越高，灭菌需时越长，因此培养基加水配备均匀后，要及时灭菌，以免其中的微生物大量繁殖影响灭菌效果。
2）培养基的含水量和均匀度：水的热传导性能较木屑、粪草、谷粒等的固体培养基要强得多，如果培养基配制时预湿均匀，吸透水，含水量适宜，灭菌过程中达到灭菌温度需时短，灭菌就容易彻底。相反，若培养基中夹杂有未浸入水分的“干料”，俗称“夹生”，蒸汽就不易穿透干燥处，达不到彻底灭菌的效果。
【提示】 培养基配制过程中，要使水浸透料，木塞、谷粒、粪草应充分预湿，浸透或捣碎，以免“夹生”。
3）容器：玻璃瓶较塑料袋热传导慢，在使用相同培养基、相同灭菌方法时，瓶装培养基灭菌时间要较塑料袋装培养基稍长。
4）灭菌方法：相比较而言，高压灭菌可用于各种培养基的灭菌，关键是把冷空气排净；常压灭菌砌灶锅小、水少、蒸汽不足、火力不足、一次灭菌过多，是常压灭菌不彻底的主要原因，并且对于灭菌难度较大的粪草种和谷粒种达不到完全灭菌效果。
5）灭菌容量：以蒸汽锅炉送入蒸汽的高压灭菌锅，注意锅炉汽化量要与锅体容积相匹配，自带蒸汽发生器高压灭菌锅，以每次容量200～500瓶（750mL）为宜。常压灭菌灶以每次容量不超过1000瓶（750mL）为宜，这样，可使培养基升温快而均匀，培养基中自然微生物繁殖时间短，灭菌效果更好。灭菌时间应随容量的增大而延长。
6）堆放方式：锅内被灭菌物品的堆放形式对灭菌效果影响显著，如以塑料袋为容器时，受热后变软，如果装料不紧，叠压堆放，极易把升温前留有的间隙充满，不利于蒸汽的流通和升温，影响灭菌效果。塑料袋摆放时，应以叠放3～4层为度，不可无限叠压，锅大时要使用搁板或铁筐。
（2）封盖不严 主要出现在用罐头瓶作为容器的菌种中，用塑料袋作为容器的折角处也有发生。聚丙烯塑料经高温灭菌后比较脆，搬运过程中遇到摩擦，紧贴瓶口处或有折角处极易磨破，形成肉眼不易看到的沙眼，造成局部污染。
（3）接种物带杂菌 如果接种物本身就已被污染，扩大到新的培养基上必然出现成批量的污染，如一支污染过的母种造成扩接的4～6瓶原种全部污染，一瓶污染过的原种造成扩大的30～50瓶栽培种的污染。这种污染的特点是杂菌从菌种块上长出，污染的杂菌种类比较一致，且出现早，接种3～5天内就可用肉眼鉴别。
这类污染只有通过种源的质量保证才能控制，这就要求作为种源使用的母种和原种在生长过程中就要跟踪检查，及时剔除污染个体，在其下一级菌种生产的接种前再行检查，严把质量关。
（4）设备设施过于简陋引起灭菌后无菌状态的改变 本来经灭菌的种瓶、种袋已经达到了无菌状态，但由于灭菌后的冷却和接种环境达不到高度洁净无菌，特别是简易菌种场和自制菌种的菇农，达不到流水线作业、专场专用，生产设备和生产环节分散，又往往忽略场地的环境卫生，忽视冷却场地的洁净度，使本已无菌的种瓶、种袋在冷却过程中被污染。(https://www.daowen.com)
在冷却过程中，随着温度的降低，瓶内、袋内气压降低，冷却室如果灰尘过多，杂菌孢子基数过大，杂菌孢子就很自然地落到了种瓶或种袋的表面，而且随其内外气压的动态平衡向瓶内、袋内移动，当棉塞受潮后就更容易先在棉塞上定植，接种操作时碰触沉落进入瓶内或袋内。瓶、袋外附有较多的灰尘和杂菌孢子时，成为接种操作污染的污染源。因此，提倡专业生产、规模生产和规范生产。
（5）接种操作污染 接种操作造成的污染特点是分散出现在接种口处，比接种物带菌和灭菌不彻底造成的污染发生稍晚，一般接种后7天左右出现。接种操作的污染源主要是接种室空气和种瓶、种袋冷却中附在表面的杂菌，有的接种操作人员自身洁净度不良，也是很重要的污染源，如违反接种操作规程、没有使用专用的工作服、工作服表面附着尘土和杂菌孢子，或不戴口罩和工作帽，手臂消毒不良等都是接种操作的污染原因。要避免或减少接种操作的污染需格外注意以下几个技术环节：
1）不使棉塞打湿：灭菌摆放时，切勿使棉塞贴触锅壁。当棉塞向上摆放时，要用牛皮纸包扎。灭菌结束时，要自然冷却，不可强制冷却。当冷却至一定程度后再小开锅门，让锅内的余热把棉塞上的水汽蒸发掉。不可一次打开锅门，这样棉塞极易潮湿。
2）洁净冷却：规范化的菌种场，冷却室是高度无菌的，空气中不能有可见的尘土，灭菌后的种瓶、种袋不能直接放在有尘土的地面上冷却。最好在冷却场所地面上铺一层灭过菌的麻袋、布垫或用高锰酸钾、石灰水浸泡过的塑料薄膜。冷却室使用前可用紫外线灯和喷雾相结合的方法进行空气消毒。
3）接种室和接种箱使用前必须严格消毒：接种室墙壁要光滑、地面要洁净、封闭要严密，接种前一天将被接种物、菌种、工具等经处理后放入，先用来苏儿喷雾，再进行气雾消毒；接种箱要达到密闭条件，处理干净后，将被接种物、菌种、工具等经处理后放入，接种前30～50min用气雾消毒、臭氧发生器消毒等方法进行消毒。
4）操作人员须在缓冲间穿戴专用衣帽：接种人员的专用衣帽要定期洗涤，不可置于接种室之外，要保持高度清洁。接种人员进入接种室前要认真洗手，操作前用消毒剂对双手进行消毒。
5）接种过程要严格无菌操作：尽量少走动、少搬动，不说话，尽量小动作、快动作，以减少空气振动和流动，减少污染。
6）在火焰上方接种：实际上无菌室内绝对无菌的区域只有酒精灯火焰周围很小的范围内。因此，接种操作，包括开盖、取种、接种、盖盖，都应在这个绝对无菌的小区域完成，不可偏离。接种人员要密切配合。
7）拔出棉塞使缓劲：拔棉塞时，不可用力直线上拔，而应旋转式缓劲拔出，以避免造成瓶内负压，使外界空气突然进入而带入杂菌。
8）湿塞换干塞：灭菌前，可将一些备用棉塞用塑料袋包好，放入灭菌锅同菌袋（瓶）一同灭菌，当接种发现菌种瓶棉塞被蒸汽打湿时，换上这些新棉塞。
9）接种前做好一切准备工作：接种一旦开始，就要批量批次完成，中途不能间断，一气呵成。
10）少量多次：每次接种室消毒处理后接种量不宜过大，接种室以一次200瓶以内、接种箱以一次100瓶以内效果为佳。
11）未经灭菌的物品切勿进入无菌的瓶内或袋内：接种操作时，接种钩、镊子等工具一旦触碰了非无菌物品，如试管外壁、种瓶外壁、操作台面等，不可再直接用来取种、接种，须重新进行火焰灼烧灭菌。掉在地上的棉塞、瓶盖切忌使用。
（6）培养环境不洁及高湿 培养环境不洁及高湿引起污染的特点是，接种后污染率很低，随着培养时间的延长，污染率逐渐增高。这种污染较大量发生在接种10天以后，甚至培养基表面都已长满菌丝后贴瓶壁处陆续出现污染菌落。这种污染多发生在湿度高、灰尘多、洁净度不高的培养室。
4.原种、栽培种制作的注意事项
（1）培养基含水量 食用菌菌丝体的生长发育与培养基含水量有关，只有含水量适宜，菌丝生长才能旺盛健壮。通常要求培养基含水量在60%～65%之间，即手紧握培养料，以手指缝中有水外渗往下滴1～2滴为宜，没有水渗为过干，有水滴连续淌下为过湿，过干或过湿均对菌丝生长不利。
（2）培养基的pH 一般食用菌正常生长发育需要一定范围的pH，木腐菌要求偏酸性，即pH为4～6，粪草菌要求中性或偏碱性，即pH为7.0～7.2。由于灭菌常使培养基的pH下降0.2～0.4，因此，灭菌前的pH应比指定的略高些。培养料的酸碱度不合要求，可用1%过磷酸钙澄清液或1%石灰水上清液进行调节。
（3）装瓶（袋）的要求 培养料装得过松，虽然菌丝蔓延快，但多细长无力、稀疏、长势衰弱；装得过紧，培养基通气不良，菌丝发育困难。一般说，原种的培养料要紧一些、浅一些，略占瓶深3/4即可；栽培种的培养料要松一些、深一些，可装至瓶颈以下。
装瓶后，插入捣木（或接种棒），直达瓶底或培养料的4/5处。打孔具有增加瓶内氧气、利于菌丝沿着洞穴向下蔓延和便于固定菌种块等作用。
（4）装好的培养基应及时灭菌 培养基装完瓶（袋）后应立即灭菌，特别是在高温季节更应如此。严禁培养基放置过夜，以免由于微生物的作用而导致培养基酸败，危害菌丝生长。
（5）严格检查所使用菌种的纯度和生命力 检查菌种内或棉塞上有无真菌及杂菌侵入所形成的拮抗线、湿斑，有明显杂菌侵染或有怀疑的菌种、培养基开始干缩或在瓶壁上有大量黄褐色分泌物的菌种、培养基内菌丝生长稀疏的菌种、没有标签的可疑菌种，均不能用于菌种生产。
（6）菌种长满菌瓶后，应及时使用 一般来说，二级种满瓶后7～8天，最适于扩转三级种，三级种满瓶（袋）7～15天时最适于接种。如果不及时使用，应将其放在凉爽、干燥、清洁的室内避光保藏。在10℃以下低温保藏时，二级种不能超过3个月，三级种不能超过2个月。在室温下要缩短保藏时间。
5.菌种杂菌污染的综合控制
1）从有信誉的科研、专业机构引进优良、可靠的母种，做到种源清楚、性状明确、种质优良，最好先做出菇试验，做到使用一代、试验一代、储存一代。
2）按照菌种生产各环节的要求，合理、科学地规划和设计厂区布局，配置专业设施、设备，提高专业化、标准化、规范化生产水平。
3）严格按照菌种生产的技术规程进行选料、配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养和质量检测。
4）严格挑选用于扩大生产的菌种，任何疑点都不可姑息，以确保接种物的纯度。
5）提高从业人员专业素质，规范操作；生产场地要定期清洁、消毒，保持大环境的清洁状态。
6）专业菌种场要建立技术管理规章制度，确保技术的准确到位，保证生产。
