一、组织工程技术

（一）原理及技术要点

组织工程是应用生命科学和工程学原理与方法，研究和开发用于修复、增进或改善人体各种组织器官损伤后功能和形态的一门学科。组织工程的提出、建立和发展为最终实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的结构、形态与功能重建开辟了新途径。组织工程技术是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一里程碑，是对外科领域组织器官缺损和功能障碍传统治疗方法的一次革命。

组织工程研究的核心是种子细胞、生物材料及组织工程化组织构建。运用血管化组织工程骨修复ORNJ骨缺损是组织工程骨转化医学的重要研究方向。虽然自体骨移植是当前临床修复ORNJ大范围骨缺损最常用的方法，但由于机体可供切取的骨来源较少，取骨量有限，切取后还会造成供区正常骨结构和功能的破坏。因此，传统修复方法仍有其局限。根据组织工程原理构建的组织工程化骨，不仅模拟了自体骨再生的过程，也符合骨再生的生物学原理。而且，与自体骨移植相比还有以下优点：①需要的供体组织少（细胞可在体外培养、增殖），供给来源不受限制，供体损伤小。②可根据缺损修复需要将植入物制成精确的三维形状。③可利用仿生技术，设计出与天然骨相似的组织工程化骨，为大段骨缺损修复提供选择。④组织工程化人工骨具有生命力，是活骨移植，可缩短骨缺损修复时间，并提高骨缺损的修复质量。因此，采用骨组织工程技术修复颌骨缺损，将是一种较为理想的修复方法。

目前，在骨组织工程中应用最广泛的种子细胞是骨髓间充质干细胞（BMMSC）。BMMSC是指骨髓基质内具有多向分化能力的前体细胞群。体外培养的BMMSC具备干细胞的两个最重要的特征：自我更新和多向分化能力。此外，BMMSC易于从骨髓中分离及体外扩增纯化。随着组织工程与再生医学的发展，它可作为种子细胞为人类细胞或组织移植提供资源，为组织缺损修复和器官移植奠定细胞基础。将其用于细胞和基因治疗的研究成为当前热点。

应用BMMSC构建骨组织至少有三种策略：①直接将体外培养扩增的BMMSC复合到生物材料，然后植入骨缺损部位。BMMSC在局部损伤微环境作用下分化为成骨细胞，并诱导局部自体BMMSC增殖分化。通过破骨细胞及各种细胞因子的作用，构建的人工骨逐渐矿物化、血管化，生物材料被吸收，最终形成具有功能的骨组织。此过程称为正位成骨或骨缺损区成骨。在构建之前，还可利用多种促骨形成因子修饰生物材料，以促进正位成骨。这些因子包括骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）裸DNA载体或BMP-2蛋白、BMP-7裸DNA或其蛋白等。此外，应用间充质干细胞的多向分化特性，还可进行关节等复杂结构的组织修复。这也是BMMSC直接复合生物材料的一个优点。②在地塞米松、β-磷酸甘油、BMP-2及BMP-7等因素作用下，BMMSC不但可获得成骨细胞表型特征，还能分泌特异性细胞外基质并出现胞外基质钙化。利用BMMSC这种体外特性，可使BMMSC体外定向分化为成骨细胞，之后再将分化的成骨细胞复合于一定形状的生物材料。或者直接将BMMSC复合于生物材料，进行体外诱导立体培养形成类骨组织，直接用于组织缺损的修复。③局部BMMSC的应用。对于小的缺损，可将高浓度细胞直接注射到病变部位，依靠局部微环境作用使BMMSC分化并成骨。由于BMMSC免疫原性低，可用异体正常BMMSC作为替代细胞，为临床推广提供了便利。(https://www.daowen.com)

除种子细胞外，骨组织工程还需要应用生物支架材料。合适的生物材料可在新生骨组织完全形成之前提供足够的空间和机械支撑，更重要的是，作为细胞外基质成分或其替代成分，能够介导细胞间信号传导和相互作用，诱导新骨形成。骨组织工程的支架材料不仅应符合一般组织工程材料的要求（例如良好的生物相容性、生物可降解性、三维多孔状结构和一定的力学强度等），还必须具备以下的特点：能够维持成骨细胞的形态和表型，促进细胞的黏附和增殖，诱导骨组织形成；材料降解速率必须与骨再生速率相匹配；支架材料可制备成至少90%的孔性结构并具一定的韧性，能在一定应力下维持原有三维立体结构。骨组织工程所用的支架材料需要有适中的强度，既能满足局部负荷要求，又不致产生应力遮挡，可在外力作用下促进成骨细胞分泌骨基质，逐渐形成新生骨并取代支架材料。目前，在骨组织工程中应用最多的支架材料是无机材料，即生物陶瓷类材料。生物陶瓷的优点包括：①主要由钙、磷组成，是骨组织的主要无机成分，可为骨组织的生成提供钙磷元素。②具有良好的生物相容性、生物可降解性和骨传导性。③材料可加工成多孔隙结构，利于组织细胞长入及营养物质出入。④材料轻度溶解所形成的高钙离子层及微碱性环境，可有效促进成骨细胞的黏附、增殖及基质分泌。⑤材料中的微量氟元素能促进成骨细胞合成DNA，并能提高碱性磷酸酶活性。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）是目前最为常用的生物陶瓷。HA具有很好的生物活性，但降解性差。TCP具有优良的降解性，但缺乏生物活性。将两者结合后形成的羟基磷灰石/β-磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）作为一种新型生物活性材料，既具有三维立体多孔结构、易降解、生物相容性好的特点，同时又降低了单纯HA生物材料的脆性，提高了机械强度。而且HA/TCP双向生物材料诱导成骨能力比单纯HA强，可以更好地修复骨缺损。

（二）组织工程在ORNJ的应用

1.骨髓间充质干细胞及羟基磷灰石/β-磷酸三钙的应用 目前BMMSC以及HA/TCP复合体已经应用于ORNJ相关治疗和研究。Jose等运用上述组织工程材料对3例下颌骨ORNJ进行治疗，取得了满意效果。他们首先在患者髂骨中获得BMMSC，并在体外培养和扩增大量内皮细胞、前体间充质细胞和造血干细胞。随后在术中去除坏死骨组织，保留下牙槽神经。在显微镜下对受损下牙槽神经清创，并用聚碳酸酯注射器将BMMSC混悬液注入神经鞘和下颌神经管，再用缺乏血小板的浆细胞膜包裹保护神经。然后以HA/TCP为支架，将扩增细胞接种到下颌骨骨缺损、肌肉组织、皮下和面神经分布区域。术后4个月在患者自体骨及复合材料上行种植体植入和上部结构修复。结果显示，3例因ORNJ造成严重畸形及病理性骨折患者的颌骨得到较好重建，口腔生物功能也得到良好的恢复。与此同时，该团队还发现骨髓间充质干/祖细胞可以有效改善下牙槽神经支配区域的麻木症状，并能促进皮肤再生、血管重建、面神经及咬肌功能的恢复。

2.基因增强组织工程技术的应用 在运用基因增强组织工程技术修复骨缺损的研究中，基因调控种子细胞的成骨和成血管作用日益受到关注，并在一系列动物实验中获得满意效果。王松灵等在建立小型猪下颌骨ORNJ模型基础上，进行了小型猪下颌骨ORNJ组织工程修复研究。结合基因增强技术，他们发现BMMSC-HA/TCP复合体回植后皮肤瘘管消失，皮肤愈合良好。CT示骨质破坏区明显修复，形态接近正常。组织病理学检查发现，移植部位为骨性愈合，形成典型的板层骨、骨松质和髓腔结构，同时骨质内还可见大量新生血管形成。