不同时间游泳运动预防高脂饮食大鼠非酒精性脂肪肝形成的机制研究

第二节　不同时间游泳运动预防高脂饮食大鼠非酒精性脂肪肝形成的机制研究

NAFL的防治目前尚无特效药物，早先人们认为NAFL不需要治疗，可以通过饮食调节来防治。有研究报道，饮食调整不能完全有效防止NAFL的发展，比如，单纯的降低体重虽可以消除肝脂肪变性，但增加了肝纤维化的程度。近些年来，对NAFL患者全面实施综合干预，通过饮食调节和运动来降低体重是最有效的治疗方法。运动防治NAFL的发生是临床医学和运动医学领域研究的重要课题之一。目前研究成果均显示，运动疗法对治疗NAFL有明显效果，但有效率报道上有较大差异。运动疗法对轻、中度NAFL疗效较为显著，对重度NAFL的效果不如前两者明显，其机制尚无专门研究。目前对运动处方的研究相对较少，且缺乏实验性研究，运动处方实施缺乏。运动项目、运动强度、运动量等标准的设置上缺乏实验性结论的支持。虽然目前研究结果尚不完全一致，但是至少可以为临床预防和治疗NAFL提供了一条新的途径和思路。本实验通过8周高脂配方饲料喂养SD大鼠以诱导大鼠产生NAFL，同时进行不同时间的游泳运动干预，观察不同时间游泳运动对高脂饮食大鼠NAFL形成的影响。

一、材料与方法

（一）实验仪器

电子分析天平　北京赛多利斯仪器系统有限公司

5810R型高速低温离心机　德国Eppendorf公司

IKA-T10basic匀浆机　德国IKA公司

微量加样器　德国Eppendorf公司

MILLI-Q纯水机　美国Millipore公司

超低温冰箱（-80℃）　Thermo公司

AF100AS冰冻切片机　Scotsman Frimont公司

高压灭菌锅　Tomy Kogyo公司

电热鼓风干燥箱　上海精宏实验设备有限公司

Bio-Rad电泳和电转移装置　美国Bio-Rad公司

凝胶图像处理系统　美国Dophin公司

（二）实验试剂

血清游离脂肪酸试剂盒　南京建成生物工程研究所

甘油三酯试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

总胆固醇试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

高密度脂蛋白胆固醇试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

低密度脂蛋白胆固醇试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

油红试剂、HE试剂　南京建成生物工程研究所

BCA蛋白定量试剂盒　Thermo公司

兔抗大鼠PPARα、SREBP-1c、SCD-1单克隆抗体　CST公司

兔抗大鼠AMPKα单克隆抗体　CST公司

小鼠抗大鼠p Akt^Ser473磷酸化多克隆抗体　CST公司

小鼠抗大鼠Akt多克隆抗体　CST公司

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG　上海康成生物工程有限公司

RIPA裂解液（强）　碧云天生物技术研究所

PMSF　上海索莱宝生物科技有限公司

4×上样缓冲液　上海索莱宝生物科技有限公司

Protein Marker　Ferments公司

十二烷基磺酸钠（SDS　Sigma公司

过硫酸铵（NH₄）₂ S₂ O₈　Amresco公司

Tris Base, SDS，丙烯酰胺，Glycine等　Ferments公司

脱脂奶粉　光明乳业有限公司

滤纸　碧云天生物技术研究所

PVDF膜　Ferments公司

ECL化学发光液　Thermo公司

其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

主要试剂配制：

（1）0.01 mM PBS溶液：

KCl 0.2 g

KH₂ PO₄ 0.24 g

Na₂ HPO₄ 1.44 g

NaCl 8 g

溶于800 mL超纯水中，用HCl调节溶液的p H至7.4，加入超纯水定容至1 000 mL，高压灭菌后，分装保存于室温或4℃冰箱中。

（2）75%乙醇：

无水乙醇75 mL

超纯水25 mL

室温保存。

（3）0.5 mol/L Tris-HCl（p H 6.8）：

Tris 10.06 g

超纯水80 mL

溶解后用浓盐酸调节p H至6.8，加入超纯水定容至100 mL，室温保存。

（4）1.5 mol/L Tris-HCl（p H 8.8）：

Tris 20.28 g

超纯水80 mL

溶解后用浓盐酸调节p H至8.8，加入超纯水定容至100 mL，室温保存。

（5）1.0 mol/L Tris-HCl（p H 6.8）：

Tris 30.29 g

超纯水200 mL

溶解后，用浓盐酸调p H至6.8，加入超纯水定容至250 mL，室温下保存。

（6）30%丙烯酰胺：

丙烯酰胺（Acr）14.5 g

N, N-亚甲双丙烯酰胺（Bic）0.5 g

超纯水定容至50 mL，置于棕色瓶中避光存放于4℃冰箱中，最长可存放1个月。

（7）10%过硫酸胺（AP）：

过硫酸胺0.1 g

超纯水1.0 mL

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

（8）10%SDS：

SDS 10 g

超纯水定容至100 mL，50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，可水浴溶化后使用。

（9）10 mmol/L PMSF：

PMSF 0.174 g

异丙醇100 mL

溶解后，-20℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/mL。

（10）20%Tween20：

Tween20 20 mL

超纯水定容至100 mL，混匀后4℃保存。

（11）电泳液缓冲液：

Tris 3.03 g

甘氨酸18.77 g

SDS 1 g

超纯水定容至1 000 mL，溶解后室温保存。

（12）转膜缓冲液：

甘氨酸14.42 g

Tris 3.03 g

甲醇200 mL

超纯水定容至1 000 mL，溶解后室温保存。

（13）TBST缓冲液：

1 mol/L Tris-HCl（p H 7.5）10 mL

NaCl 8.8 g

Tween20 1 mL

超纯水定容至1 000 mL，高压灭菌后分装，室温下保存。

（14）封闭液：

BD脱脂奶粉5 g

TBST 100 mL

现用现配。

（三）动物模型的建立

1．实验动物和喂养

6周龄SD纯系雄性大鼠70只，体重（200±20）g，购于南京鹏昇生物科技有限公司。所有大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机分为7组：普通饲料对照组（C组）、高脂饮食对照一组（H1组）、高脂饮食+60 min运动预防组（HE60-1组）、高脂饮食+90 min运动预防组（HE90-1组）、高脂饮食对照二组（H2组）、高脂饮食+60 min运动治疗组（HE60-2组）、高脂饮食+90 min运动治疗组（HE90-2组），每组各10只。根据实验分组要求，分组后的大鼠，C组大鼠给予普通饲料喂养，其他各组大鼠给予高脂饲料喂养。高脂饲料在低温冰箱保存，喂饲前常温复温，C组、H1组、HE60-1组、HE90-1组持续喂养12周。H2组、HE60-2组和HE90-2组大鼠持续喂养至20周。

大鼠分笼饲养，每笼10只，饲养笼选用塑料制品并配不锈钢罩、塑料吸水瓶和不锈钢吸水管，各组大鼠每天自由进食饮水。室温控制在（22±3）℃，相对湿度为40%～60%，每天自然光照。普通标准啮齿类动物饲料和高脂饲料均由江苏南通特洛菲饲料科技有限公司提供。高脂饲料配方根据参考文献[30-33] 等改良。基础饲料与高脂饲料配方同本章第一节。

2．实验动物分组和运动方案

大鼠普通饲料喂养1周后，通过游泳运动预防脂肪肝形成的大鼠随机分为3组：高脂饮食对照组1（H1组）、高脂饮食+60 min运动组（HE60-1组）、高脂饮食+90 min运动组（HE90-1组）。根据实验分组要求，分组后的大鼠，均给予高脂饲料喂养。高脂饲料在低温冰箱保存，喂饲前常温复温，持续喂养12周。同时，H1组大鼠常规活动，不进行运动干预，HE60-1组和HE90-1组分别进行不同时间的游泳运动。第1周，HE60-1组和HE90-1组大鼠需进行适应性游泳运动，且每天游泳运动时间逐渐递增，直至游满改组运动时间要求。HE60-1组大鼠第1天进行15 min适应性游泳，随后几天分别以15 min为递增梯度，直到游满60 min; HE90-1组大鼠第1天进行15 min适应性游泳，随后几天分别以15 min为递增梯度，直到游满90 min。第2周开始，HE60-1组大鼠分别以60 min/d进行游泳运动，HE90-1组大鼠以90 min/d进行游泳运动，每周游泳6天，直到实验结束。具体运动时间安排见表3-9。

游泳缸内壁光滑，体积为100 cm×70 cm×60 cm，水深50 cm，水温（30±1）℃。运动时注意大鼠的状态，以防止溺水死亡，并及时捞出老鼠粪便，以保持游泳池的清洁。游泳运动时间均安排在上午进行。12周实验结束后，C组和H1组大鼠无损失，运动组大鼠有溺亡，最终纳入统计的各组大鼠为8只，共64只。

（四）动物取材

1．取材方法

高脂饲料喂养12周结束，C组和H1组在取材前一天禁食12 h，自由饮水。取材器械均经过高压灭菌消毒并高温（200℃）烘烤6 h。腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg），麻醉后，腹主动脉采血8 mL，4℃冰水中静置20 min，4℃离心（3 500 rp m）15 min，取血清，-30℃保存备用。

完整剥离肝脏，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，电子天平称重，记录肝湿重数据。取部分肝右叶组织，放于经0.1%DEPC处理的无RNA污染的去离子水中，漂洗去血渍。在冰浴条件下，取新鲜组织，进行冰冻切片。取少许肝右叶组织，按照1∶9（W/V）的比例加入4℃生理盐水，制备10%肝组织匀浆，然后在冰浴中进行手工匀浆，匀浆液4℃离心（12 000 rp m）15 min，取上清，-30℃保存，待测肝脏生化指标。切取肝右叶约200 mg放入液氮冻存管，投入液氮罐中保存备用。

2．切片制作

新鲜组织当天进行冷冻切片，常规HE染色，光学显微镜下观察肝组织形态学变化。

1）冷冻切片步骤

（1）取材，将新鲜肝脏切成体积为24 mm×24 mm×2 mm的小块。

（2）取出冷冻切片机中组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂（保证包埋充分没有气泡），迅速放于冷冻台上，冰冻，冰冻温度调至-17～-23℃左右，时间为3～5 min。

（3）将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，将组织修平。

（4）调好欲切的厚度，肝组织厚度取10～16μm。

（5）调好防卷板。应将防卷板调校到最佳位置，切片时，切片可以顺利到防卷板间的通道，舒展在持刀器的铁板上。最后掀起防卷板，迅速将其附贴于载玻片上。

2）HE染色步骤

95%酒精Ⅰ1 min→95%酒精Ⅱ1 min→自来水冲洗片刻→苏木素染色8 min→水洗→1%盐酸分化5sec→水洗→5%伊红酒精染色1 min→95%酒精Ⅰ1 min→95%酒精Ⅱ1 min→100%酒精Ⅰ1 min→100%酒精Ⅱ1 min→二甲苯Ⅰ1 min→二甲苯Ⅱ1 min→封胶→盖玻片→风干保存→镜下观察→显微摄影。

（五）指标测试与方法

1．体重与摄食量

体重测定方法：在实验大鼠清醒状态下，于每周五（该日不运动）使用电子秤测定大鼠体重，所有测定由一人操作读数。每日记录大鼠摄食量。

2．血脂（ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL）、肝脂（CHOL、TG）测定

血脂、肝脂均采用比色法，在全自动分析生化仪上按试剂盒说明测定。

3．肝脏指数测定

肝脏指数（%）=（肝脏湿重量／体重）×100%

4．血清与肝脏FFA含量测定

血清与肝脏FFA测定采用比色法，在722分光光度计上按照试剂盒说明测定，试剂盒购于南京建成物工程研究所，具体操作步骤如下。

1）原理

FFA能与铜离子结合形成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其含量与FFA含量成正比。用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可推算出FFA的含量。

2）试剂组成与配制（50T）

（1）试剂一：液体，60 mL×4瓶，室温保存，极易挥发，请于1个月内完成检测。

（2）试剂二：缓冲液，40 mL×1瓶，室温保存6个月。

（3）试剂三：铜试剂，甲液30 mL×1瓶，乙液30 mL×1瓶，丙液5 mL×1瓶，4℃保存6个月。

临用时以甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1混合配成铜试剂，需多少配多少，配好后4℃保存2周。

（4）试剂四：显色剂，粉剂×2支，稀释液10 mL×2瓶，4℃保存3个月。

临用时用1瓶10 mL稀释液溶解1支粉剂，配好后4℃可保存2周。

（5）试剂五：棕榈酸标准品粉剂×2支，溶剂50 mL×1瓶，4℃保存1个月。

1μmol/L棕榈酸标准品的配制：将一支粉剂用溶剂溶解后定容至20 mL，混匀。（注意需用溶剂将装粉剂的小离心管洗净）。

（6）试剂六：双蒸水20 mL×1瓶（做空白管用）。

3）操作步骤

（1）实验仪器：玻璃试管，注射器，硬膜外麻醉针心针套，混匀器，移液器，离心机，分光光度计。

（2）分别取玻璃试管进行编号（最好用带盖的玻璃磨口试管进行实验，防止试剂发挥及更好的抽取）。

（3）操作表。

混匀，室温放置2 min，在440 nm、1 cm光径，试剂一调零比色。

4）计算公式

血清FFA含量（μmol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管浓度（1 000μmol/L）。

5．肝脏总RNA的提取

1）准备工作

玻璃制品用0.1M的氢氧化钠浸泡过夜，用自来水冲洗干净，再用超纯水冲洗数次，180℃烘烤6 h后备用；Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜后，经高压灭菌、烘干后备用；超净台在使用前30 min用紫外线照射灭菌。

2）肝脏提取总RNA

用Trizol法提取大鼠肝脏组织中的总RNA，具体步骤如下：

（1）将存于液氮中的组织样品取出后，置入已预冷的研钵中，加入少量液氮并迅速研磨，待组织变软时，再加入少量液氮继续研磨，重复数次，直至组织完全变成粉末，取50～100 mg粉末加入装有1 mL Trizol的离心管中，室温静置5 min。

（2）4℃，10 000 rp m离心10 min，取上清液，置入新的离心管。

（3）向上清液中加入0.2 mL氯仿，漩涡剧烈震荡15 s后，室温静置3 min。

（4）4℃，15 000 rp m离心15 min，溶液分为三层（红色有机相、中间层和上层无色水相），将水相转移至新的试管中。

（5）向水相中加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，于-20℃静置30 min。

（6）4℃，10 000 rp m离心10 min，管侧壁及管底可见白色胶状沉淀，弃上清。

（7）用1 mL 75%的乙醇（用经DEPC处理过的蒸馏水配制）洗涤白色胶状沉淀。

（8）4℃，10 000 rp m离心2 min，移液器仔细吸弃上清。

（9）重复（7）、（8）步骤1次。

（10）室温干燥沉淀，待沉淀完全透明后，加适量无酶水回溶，用移液器吹打数次，促进RNA溶解。

3）RNA质量和浓度检测

使用变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性、Nano Drop 1000核酸蛋白测定仪测定浓度。将样品RNA稀释至100 ng/μL，-80℃保存备用。

6．实时荧光定量PCR测定大鼠骨骼肌PPARα、SREBP-1c、SCD-1 mRNA的表达量

1）引物设计

在NCBI的Nucleotide数据库中寻找目标mRNA的核酸序列，使用Primer Premier 5.0设计目的基因的扩增引物，接着使用Blast软件对引物的特异性进行匹配，最后使用Oligo 7.37筛选最优化的引物（表3-10）。

2）实时荧光定量反应体系

见表3-11。

3）实时荧光定量反应条件

见图3-12。

4）实时荧光定量结果的计算

实时荧光定量的结果采用2^-ΔΔCt方法进行处理。

计算公式：ΔΔCt=（待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值）-（对照组目的基因Ct平均值-对照组管家基因平均Ct值），即每一个目的基因表达经内参均一化处理后相对于某个组织的倍数（2^-ΔΔCt）。其中Ct（初始循环数）为扩增曲线与Threshold line交点的横坐标值，即在PCR扩增的过程中，荧光信号达到设定的阈值时，所需要完成的循环数。

7．肝脏p Akt^Ser473磷酸化水平、Akt、AMPK、PPARα、SREBP-1c和SCD-1蛋白表达的测定

1）收集蛋白质样品（protein sample preparation）

（1）取肝脏组织块称重500 mg。

（2）利用液氮、研钵粉碎组织块。

（3）加入Roche Lysis Buffer缓冲液（每克组织2 mL RIPA）和PMSF，采用电动匀浆机17 000 rp m，30 s制备组织匀浆。整个操作在冰上进行。

（4）将匀浆液移入离心管，4℃15 000 rpm离心15 min。

（5）上清液为细胞裂解液，将上清液移入新的EP管，加入4×上样缓冲液。

（6）100℃水浴加热5 min，以充分变性蛋白。

（7）分装，-20℃保存。

2）蛋白浓度测定

按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50∶1）配制成BCA工作液，充分混匀。取10μL完全溶解蛋白标准品，稀释至100μL，使终浓度为0.5 mg/mL。将0、1、2、4、8、12、16、20μL标准品加到96孔板的标准品孔中，再加标准品稀释液补足到20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL。各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30 min。562 nm处测各管吸光度值。

3）SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳（electrophoresis）

（1）SDS-PAGE凝胶配制：先制备分离胶，凝胶浓度为10%。灌胶前加入APS和TEMED。用注射器将配制好的溶液缓慢加入装配好的板中至凝胶高度为6 cm左右。每板凝胶溶液上覆盖无水乙醇，放置1h左右至聚合完全。然后使用滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，开始配制浓缩胶。用10 mL注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。将聚合好的胶与电泳槽连接，安装，固定好，在上层槽和下层槽中加入相同电泳缓冲液。

（2）样品上样：按上样量40μg决定上样体积，确定每孔加样蛋白质总量相等。

（3）电泳：为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，使用预染蛋白质分子量标准。电泳在浓缩胶时使用40 V恒压电泳，在溴酚蓝指示进入下层分离胶时使用35 mA左右恒流电泳。根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即停止电泳。

4）转膜（transfer）

准备好Bio-Rad蛋白转移装置夹板，凝胶用转移缓冲液稍微清洗。将吸水纸，滤纸在转移液中浸湿，按如下顺序装配于转移装置上：吸水纸-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-吸水纸，排出气泡。将转印夹层装置置转膜电泳槽内，凝胶一侧靠近负极，PVDF膜一侧靠近电泳槽正极，280 mA恒流条件下，转膜80 min。

5）封闭（blocking）

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的PBST洗涤液中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。加入PBST+5%BSA封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭120 min。

6）一抗孵育（primary antibody incubation）

按照1∶200比例用PBST稀释液稀释一抗。4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。用1×PBST洗涤10 min，共洗涤3次。

7）二抗孵育（secondary antibody incubation）

参照二抗的说明书，按照1∶5 000比例用Western二抗稀释液PBST稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2小时。用1×PBST洗涤10 min，共洗涤3次。

8）结果检测分析

将ECL化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液。将膜从PBST中取出，放置在凝胶成像系统仪器托板上，加上反应液曝光。拍照后保存，采用AlphaView SA图像分析软件对条带灰度进行分析和比较。

（六）统计学处理

实验数据均采用平均数±标准误表示，所测定的结果用SPSS 17.0软件进行分析，采用单因素方差分析进行组间比较，实验前后比较用配对t检验，统计学显著性为P＜0.05，非常显著性为P＜0.01，具有统计学意义。

二、实验结果

（一）运动对大鼠外观情况的影响

在实验过程中，H1组大鼠皮毛蓬乱无光泽，体毛部分呈蜡黄色、杂乱无光泽，嗜睡，活动减少，体重增速大。HE60-1组和HE90-1组大鼠与H1组相比，体毛较干净，精神状态很好，较活泼。

（二）运动对大鼠体重和摄食量的影响

由分析结果可知，实验前，四组大鼠的体重无显著性差异（P＞0.05）；8周实验后，各个组大鼠体重均显著增长（P＜0.01）：C组大鼠体重增长了（226.27±34.22）g, H1组大鼠体重增长了（354.47±51.93）g, HE60-1组大鼠体重增长了（282.82±16.99）g, HE90-1组大鼠体重增长了（231.81±25.71）g; H1组大鼠体重极显著高于C组大鼠（P＜0.01），HE60-1组和HE90-1组大鼠体重显著低于H1组大鼠（P＜0.05），且HE90-1组大鼠体重显著低于HE60-1组大鼠（P＜0.05）（表3-12、表3-13、图3-13、图3-14和图3-15）。说明高脂饮食可显著增加体重，运动可有效控制体重的增加。

（三）高脂饮食大鼠肝湿重和肝指数的变化

表3-14和图3-16显示，8周实验后，H1组大鼠肝湿重和肝脏指数均显著高于C组（P＜0.01，P＜0.05）。与H1组大鼠相比，HE60-1组和HE90-1组大鼠肝湿重和肝脏指数均显著低于H1组（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）。

（四）运动对大鼠血清FFA和血脂的影响

由表3-15、图3-17和图3-18可知，H1组大鼠FFA、TC、TG、HDL、LDL、FFA均显著升高（P＜0.01）。H60-1组和H90-1组大鼠的TC、TG、FFA均显著低于H1组大鼠（P＜0.01），H90-1组的LDL显著低于H1组；H60-1组和H90-1组大鼠之间的TC、TG、HDL、LDL、FFA水平均无显著差异（P＞0.05）。

（五）运动对大鼠肝脏功能的影响

由表3-16和图3-19可知，H1组的ALT、AST水平与C组相比均极显著较高（P＜0.01）；与H1组相比，HE60-1组和HE90-1组大鼠肝脏ALT与AST水平均极显著下降（P＜0.05）；HE60-1组和HE90-1组大鼠肝脏ALT、AST水平不存在显著差异（P＞0.05）。

（六）运动对大鼠肝脏TG、TC和FFA的影响

由表3-17、图3-20和图3-21可知，H1组大鼠肝脏TC、TG、FFA水平与C组相比极显著升高（P＜0.01）；HE60-1组和HE90-1组大鼠肝脏TC、TG、FFA水平均极显著低于H1组（P＜0.01）；HE60-1组和HE90-1组大鼠肝脏TC、TG、FFA水平无显著性差异（P＞0.05）。

（七）运动对大鼠肝脏形态及肝组织变化的影响

1．肝组织观察

图3-22显示：H1组大鼠肝脏颜色已变成浅黄色，肝脏体积明显增大，肥厚，边缘饱满，切片时难成形，易碎，刀面有较多脂肪沾染；HE60-1组大鼠肝脏与H1组相比，体积明显减小，颜色呈浅褐色，刀切时脂肪沾染少；HE90-1组肝脏与HE60-1组比，无论形态还是颜色，更接近于正常肝脏，颜色偏红褐色，刀切时脂肪沾染极少。

2．肝组织形态学观察

由图3-23可知：200倍光镜下，C组大鼠肝细胞无脂肪变性和炎性细胞浸润，中央静脉为中心发射状排列，肝小叶结构正常，细胞索排列整齐，肝窦间隙正常；H1组大鼠肝细胞严重脂肪变，细胞核挤向边缘，肝小叶难以辨认，细胞肿胀，胞浆疏松且有较大空泡，有炎症浸润；HE60-1组大鼠肝细胞见轻度脂肪变，部分肝索排列紊乱，胞浆内有大小不等的脂肪滴；HE90-1组大鼠肝细胞基本上是以中央静脉为中心呈放射状排列，偶见微量小泡性脂肪滴，与正常肝脏最为接近。

（八）运动对大鼠Akt蛋白表达水平的影响

由表3-18和图3-24可知，与C组相比，H1组大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平显著下降（P＜0.01）；与H1组相比，HE60-1和HE90-1组大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平显著提高（P＜0.05，P＜0.01）。但HE60-1和HE90-1组大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平组间无显著性差异。各组大鼠肝脏Akt总蛋白无显著差异（P＞0.05）。

（九）运动对大鼠AMPKα蛋白表达水平的影响

由表3-19和图3-25可知，与C组相比，H1组大鼠肝脏AMPK蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）；与H1组相比，HE60-1和HE90-1组大鼠肝脏AMPK蛋白表达水平显著提高（P＜0.01）。但HE60-1和HE90-1组大鼠肝脏AMPK蛋白表达水平组间无显著性差异。

（十）运动对大鼠SREBP-1c、SCD-1、PPARα表达水平的影响

表3-20和图3-26分析结果显示，与C组相比，H1组大鼠肝脏SREBP-1c、SCD-1mRNA表达水平极显著增加（P＜0.01，P＜0.01），PPARαmRNA表达水平显著下降（P＜0.01）；与H1相比，HE60-1组和HE90-1组大鼠肝脏SREBP-1c、SCD-1表达极显著下降（P＜0.01，P＜0.01），PPARα基因表达水平显著升高（P＜0.01），且HE60-1组和HE90-1组之间SREBP-1c、SCD-1和PPARα的基因表达水平无显著差异（P＞0.05）。

表3-21和图3-27结果显示，与C组相比，H1组大鼠SREBP-1c、SCD-1蛋白表达水平显著增加（P＜0.01，P＜0.01），PPARα蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）；与H1相比，HE60-1组和H90-1组SREBP-1c、SCD-1蛋白表达极显著下降（P＜0.01，P＜0.01），PPARα蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），且HE60-1组和HE90-1组之间SREBP-1c、SCD-1和PPARα的蛋白表达水平无显著差异（P＞0.05）。

三、讨论

NAFL是代谢综合征中的一种，迄今为止尚无有效的药物可以全面抑制其发病过程。而运动作为防治NAFL的非药物手段，已越来越得到人们的关注与认可。已有研究表明，在以运动作为干预手段的动物实验中，大多采用对大鼠进行游泳训练作为运动方式。闫焕焕等的研究认为，对雄性SD大鼠进行为期10周的高脂饮食喂养，同时进行无负重游泳运动干预（6 d／周，从15 min/d每天递增10～20 min周后直至增至60 min，保持该运动量10周），结果证实，在高脂饮食的同时进行60 min游泳运动干预可以有效预防肝细胞损伤的发生，其机制可能是通过加强高脂饮食大鼠肝脏中氧自由基的代谢而提高了肝脏抗氧化能力。丁文斌等的实验结果表明，对SD大鼠进行高脂饮食饲喂，同时给予90 min/d、5 d／周中等强度的游泳运动，持续8周。8周后实验结果显示，运动组大鼠血清AST、ALT均显著低于NAFL模型组，说明中等强度的游泳运动能够改善由高脂饮食所致的NAFL肝脏脂肪病变。尽管目前基于动物模型对运动与NAFL关系的研究较多，且报道结果都证实运动对NAFL有一定的影响，但是采取的干预方法较单一。至于不同运动方式、不同运动时间、不同运动强度等不同的运动方案对于NAFL的影响是否一致，哪种运动方案更有效果还是在一定的运动强度范围的运动方案之间无显著差异，目前尚未有明确的研究报道。

因此，本实验在研究的基础上设计以下两种不同运动时间的训练方案：采取无负重游泳的方式，对高脂饮食大鼠进行60 min/d和90 min/d、1周6次、共12周的游泳运动，旨在探究不同运动方案在预防NAFL发病机制中的影响。

（一）不同运动方案对大鼠体重的影响

本实验中，C组、H1组、HE60-1组和HE90-1组大鼠实验前体重无显著性差异，三组高脂饮食大鼠所饲喂的饲料配方相同。12周实验期间，各组大鼠生长发育良好，体重均稳步增长。12周实验后，H1组大鼠体重显著高于HE60-1组和HE90-1组，表明高脂饲料所含的多余热量以脂肪形式存储于大鼠体内。持续中等强度的有氧运动需要大量消耗ATP，使脂肪成为机体主要供能能源，运动时间越长，脂肪供能比例越大。本研究的结果再次表明高脂饮食运动组大鼠体重显著低于不运动高脂饮食大鼠，且本实验中，90 min运动组大鼠体重显著低于60 min运动组。因此，长期规律的游泳运动可有效控制因高脂肪饮食而形成的NAFL大鼠体重水平。本实验结果提示，运动时间越久，大鼠消耗的能量越多，运动控制体重的效果越好。

（二）不同运动方案对高脂饮食大鼠脂质代谢及肝功能的影响（血清FFA、血脂、肝脂和肝功能）

FFA作为脂肪代谢的中间产物，FFA是细胞膜脂质结构和前列腺素合成的供体，人体必不可少的物质。人体饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸主要靠机体自身合成；多不饱和脂肪酸需从食物中摄取。正常情况下肝脏FFA主要有3个来源：①以乳糜微粒的形式从食物中摄取；②脂肪组织的脂肪分解；③从乙酰辅酶重新合成。当大量FFA在肝脏沉积后，不能及时再被分泌到血液循环中，肝细胞脂代谢负荷过重，大量的TG在肝细胞内沉积，导致脂肪肝的发生。正常情况下，肝脏和脂肪组织间存在FFA或TG循环：肝脏将合成的TG以VLDL-TG形式释放。脂肪组织通过脂蛋白脂酶水解VLDL-TG为脂肪酸，在脂肪组织内再酯化为TG储存，同时又经常以FFA形式输送至肝脏。本实验中，60 min和90 min游泳运动均显著降低了高脂饮食大鼠血清和肝脏FFA、TC和TG水平，说明规律的运动可以增加高脂饮食大鼠基础代谢率，使安静状态下脂肪功能增加，从而活化FFA摄取系统，增强机体摄取脂肪的能力。这说明60 min和90 min游泳运动均能够增强高脂饮食大鼠机体的氧化功能，肝脏内的FFA因更多地参加了氧化供能而有所减少，从而相应减少TG的酯化以及在肝脏内脂肪的合成。此外，由于长期规律的运动干预后，大鼠肝脏本身氧化脂肪酸的能力也得到增强，从而减少了脂肪与肝脏间的FFA或TG循环。本研究同时观察了高脂饮食大鼠肝功能的变化及运动干预的效果，结果发现高脂饮食大鼠肝脏功能有所下降。而采用运动干预的高脂饮食大鼠，无论是60 min还是90 min游泳运动，两种不同的运动方案均能有效改善高脂饮食大鼠肝功能，但从实验结果分析，这两种运动方案的干预效果无显著差异。

（三）运动预防高脂饮食大鼠NAFL形成的机制分析

1．不同运动方案对高脂饮食大鼠肝脏Akt的影响

研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信号途径由PI3K和下游分子PKB/Atk、GSK3和p70s6k等组成。其中，PI3K/Akt通路与NAFL有着紧密的联系，Akt活性降低易导致IR和NAFL的发生及进展。PI3K/Akt通路是调节细胞增殖、分化、凋亡和衰老的经典信号途径。近年来有研究发现，运动（跑台、游泳等）可激活PI3K/Akt，增强PI3K/Akt信号转导。此外有研究表明，高脂饮食喂养的大鼠肝细胞中PI3K和Akt蛋白表达量显著减少，提示高脂饮食大鼠肝脏细胞PI3K/Akt信号转导异常。为了验证在NAFL形成过程中，运动对高脂饮食大鼠肝脏PI3K/Akt信号的干预作用，本研究通过高脂饮食喂养SD大鼠，建立NAFL动物模型，同时采用60 min和90 min无负重游泳运动方式进行干预，观察了运动对高脂饮食大鼠肝脏Akt的影响。结果表明，高脂饮食大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平显著下降，PI3K/Akt信号转导异常，而两种不同方案的游泳运动均能够显著增强高脂饮食大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平，从而增强Akt信号转导。说明运动对高脂饮食大鼠肝脏Akt信号转导作用具有一定的改善作用。

2．不同运动方案对高脂饮食大鼠肝脏AMPK的影响

AMPK具有调节机体能量物质代谢，维持能量动态平衡的作用，是细胞的能量开关。当AMPK被激活时，它不仅可以激活下游的靶分子，还可以启动ATP代谢分解途径。近年来，大量文献对运动过程中AMPK的激活及其分子机制进行了研究。Stephens等对7名健康志愿者进行了68%VO_2max中等强度自行车运动的研究，结果发现：5 min时，AMPKα2活性增加了2倍；30 min时AMPKα2活性增加3倍。有研究表明，随着运动强度的增加，AMPKα1与AMPKα2的活性也上调，并且AMPKα2的活性增加更加明显。Langfort等对8名健康男性进行了4周自行车训练后，检测了AMPKα的蛋白表达水平：AMPKα2蛋白表达增加27%，而AMPKα1蛋白表达无显著变化。以上研究表明，AMPK的活性随着运动时间的延长而增加，而且与运动强度呈正向调节。因此推测，AMPK活性的增加具备对运动时间和运动强度的双重依赖性。一般认为，运动强度在中等以上才能导致AMPK被显著激活，但也有长时间运动能够激活AMPK的相关报道。目前对于运动对AMPK的影响多局限于骨骼肌的研究。本研究结果表明，高脂饮食后，大鼠肝脏AMPKα的蛋白表达水平显著降低，而游泳运动可使高脂饮食大鼠肝脏AMPKα蛋白表达水平显著提高。

3．不同运动方案对高脂饮食大鼠肝脏PPARα、SREBP-1c、SCD-1表达水平的影响

PPARs是过氧化物酶体、线粒体的关键转录因子，是核受体超家族的成员，是公认的脂质传感器，有脂质代谢的作用。SREBPs是一个转录因子，控制胆固醇和脂类的生物合成。SREBP-1c是SREBP家族的一个成员，是转录激活所需的脂肪合成基因。此外，SREBP-1c介导胰岛素作用。PPARα和SREBP-1c、SCD-1除了是一种酶，还是控制脂平衡的关键点。SCD-1是不饱和脂肪酸生物合成的限速步骤，这会使TG和胆固醇合成受损，降低VLDL水平。在缺少SCD-1时，肝脏贮脂功能和VLDL的产生受到抑制，脂肪酸氧化减少，同时PPARα和SREBP-1c的表达也发生变化，这有助于预防肝内SCD-1所致的脂肪变性，凸显其在肝内调控脂质平衡的重要作用。

4．运动在预防高脂饮食大鼠肝脏NAFL形成中的作用及机制

目前对NAFL患者和动物模型的研究发现，运动可以减少肝脏中脂质异常堆积。Rector等的研究发现，运动后ACC活性显著降低，磷酸化水平显著升高，导致肝脏脂质氧化水平增加，肝脏脂质堆积减少。研究表明，持续运动训练可下调大鼠肝脏中SCD-1表达量，减少肝脏中脂质沉积，促进肝细胞内脂质代谢平衡。长期有氧运动既有助于提高大鼠肝脏内AMPKα各亚基蛋白表达水平及磷酸化水平，又可以提高肝脏对胰岛素的敏感性，这些在调节肝脏脂质代谢方面起重要作用。此外，PI3K/Akt信号通路在肝脏脂质代谢中的作用已得到许多学者的认可。当前关于运动对PI3K/Akt影响的相关研究也颇为丰富。多数研究表明，运动可增强PI3K/Akt的信号转导。因此，我们推测，运动可能通过对PIK/Akt的信号转导的增强，影响SREBP-1c/SCD1的表达，从而改善肝脏脂质代谢。有研究发现，运动可以增强PI3K/Akt的信号转导，激活AMPK信号通路，降低SREBP-1c/SCD1的表达，减少肝脏脂质合成。另外也有研究证实，3个月的有氧运动增加了老年小鼠肝脏Akt的磷酸化水平，增加了肝脏mTOR的蛋白表达水平，继而通过降低SREBP-1c/SCD1的表达，从而减少肝脏脂质合成。但运动干预对肝脏脂质代谢的影响，受到运动方式、运动强度和运动时间等要素的影响，而现有研究对于运动强度和方式的选择尚存在一定的争议。本研究结果也证实：运动后，高脂饮食大鼠肝脏脂质堆积减少，肝脏Akt蛋白、AMPKα蛋白表达水平均增加，肝脏脂肪代谢相关基因SREBP-1c和SCD-1表达发生显著下降，PPARα表达水平显著提高。说明运动可增强高脂饮食大鼠肝脏PI3K/Akt信号转导，从而增强AMPK蛋白表达，一方面可能直接通过抑制PPARα或SREBP-1c表达水平而促进高脂饮食大鼠肝脏脂质的代谢，另一方面可能通过mTOR的介导作用，间接影响高脂饮食大鼠脂质代谢：①通过降低mTOR的表达，促进PPARα的表达，从而促进高脂饮食大鼠肝脏脂质代谢；②通过降低mTOR的表达水平，抑制SREBP-1c的表达，进而减少SCD-1的生成，从而抑制肝脏脂质生成速率。

四、结论

12周60 min游泳运动和90 min游泳运动均可有效的预防高脂饮食诱导的NAFL形成，其机制可能是：①游泳运动可增强高脂饮食大鼠肝脏PI3K/Akt信号转导，从而增强AMPK蛋白表达，并直接抑制PPARα或SREBP-1c表达水平，从而促进高脂饮食大鼠肝脏脂质的代谢，最终预防高脂饮食大鼠NAFL的形成；②游泳运动可增强高脂饮食大鼠肝脏PI3K/Akt信号转导，增强AMPK蛋白表达，抑制mTOR的表达，间接影响高脂饮食大鼠脂质代谢。mTOR的表达受抑制后，一方面可促进PPARα的表达，从而促进高脂饮食大鼠肝脏脂质代谢；另一方面可抑制SREBP-1c的表达，进而减少SCD-1的生成，从而抑制肝脏脂质生成速率，最终预防高脂饮食大鼠NAFL的形成。但在运动预防NAFL的干预效果中，这两种不同的游泳方案无显著差异。