非酒精性脂肪肝动物模型的建立与评价
NAFL是一种无过量饮酒史的肝脏代谢性慢性病。近年来由于人们饮食结构的变化，脂肪肝的发病率逐年递升。目前临床及基础研究方面存在诸多问题，如动物模型不规范、未能真正反映不同病因病机所致的脂肪肝，观察指标少，疗效判定不客观等问题。由于脂肪肝发生机理各异，研究不同方法不同原因所造的动物模型就显得尤为重要。现代脂肪肝动物模型主要有体外和体内两种。体外模型在国内外研究较少，主要用于细胞水平进行脂肪肝发病机制及干预治疗的研究。体内模型主要分为非酒精性脂肪肝模型和酒精性脂肪肝模型，主要用于探索脂肪肝发病机制、筛选药物、评价诊断方法等的研究。目前已知临床发病率较高的NAFL为高脂血症性脂肪肝，其次为肥胖性脂肪肝，而其他脂肪肝虽有发生，但不多见。为此，当前开展对NAFL模型的方法学研究多以高脂血症性脂肪肝和肥胖性脂肪肝为主。在模型建构中以营养失调性大鼠脂肪肝模型且此种建模方式较为稳定、成熟，造价相对低廉，因而被认为是目前最有效的造模方式。本实验通过12周高脂配方饲料喂养正常SD大鼠以诱导大鼠发生NAFL，并采用常规手段评价建模，为后续的相关实验研究奠定基础。
一、材料与方法
（一）实验仪器
电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司
5810R型高速低温离心机 德国Epp endorf公司
微量加样器 德国Epp endorf公司
MILLI-Q纯水机 美国Millipore公司
超低温冰箱（-80℃） Thermo公司
AF100AS冰冻切片机 Scotsman Frimont公司
全自动生化仪 日本日立公司
分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司
光学显微镜 Scope Technology公司
高压灭菌锅 Tomy Kogyo公司
（二）实验试剂
血清游离脂肪酸试剂盒 南京建成生物工程研究所
甘油三酯试剂盒 北京北化康泰临床试剂有限公司
总胆固醇试剂盒 北京北化康泰临床试剂有限公司
高密度脂蛋白胆固醇试剂盒 北京北化康泰临床试剂有限公司
低密度脂蛋白胆固醇试剂盒 北京北化康泰临床试剂有限公司
HE试剂 南京建成生物工程研究所
（三）动物模型的建立
1．实验动物和喂养
6周龄SD纯系雄性大鼠20只，体重（200±20）g，购于南京鹏昇生物科技有限公司（许可证编号：SCXK-2009-0001）。大鼠分笼饲养，每笼10只，饲养笼选用塑料制品并配不锈钢罩、塑料吸水瓶和不锈钢吸水管，大鼠每天自由进食饮水。室温控制在（22±3）℃，相对湿度为40%～60%，每天自然光照。普通标准啮齿类动物饲料和高脂饲料均由江苏南通特洛菲饲料科技有限公司提供。高脂饲料配方根据参考文献等改良。基础饲料与高脂饲料主要成分和热量比见表3-1和表3-2。
表3-1 饲料主要成分表（g/1 000 g饲料）
表3-2 基础饲料和高脂饲料蛋白质、脂肪和碳水化合物的供能比
2．实验动物分组
所有大鼠普通饲料喂养1周后，随机分为2组，普通饲料对照组（C组）、高脂饮食对照组（H组）。每组各10只。根据实验要求，分组后C组大鼠给予普通饲料喂养，H组大鼠给予高脂饲料喂养。高脂饲料在低温冰箱保存，喂饲前常温复温，持续喂养12周。整个喂养过程中，C组和H组大鼠无损失，最终纳入统计的各组大鼠为10只，共20只。
（四）动物取材
1．取材方法
高脂饲料喂养12周结束，C组和H组在取材前一天禁食12 h，自由饮水。取材器械均经过高压灭菌消毒并高温（200℃）烘烤6 h。腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg），麻醉后，腹主动脉采血8 mL，2 500 rpm离心10 min，取上清，-20℃保存备用。
完整剥离肝脏，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，电子天平称重，记录肝湿重数据。取部分肝右叶组织，放于经0.1%DEPC处理的无RNA污染的去离子水中，漂洗去血渍。在冰浴条件下，取新鲜组织，进行冰冻切片。取少许肝右叶组织，按照1∶9（W/V）的比例加入4℃生理盐水，制备10%肝组织匀浆，然后在冰浴中进行手工匀浆，匀浆液4℃离心（12 000 rpm）15 min，取上清，-20℃保存，待测肝脏生化指标。切取肝右叶约200 mg放入液氮冻存管，投入液氮罐中保存备用。
2．切片制作
新鲜组织当天进行冷冻切片，常规HE染色，光学显微镜下观察肝组织形态学变化。
1）冷冻切片步骤
（1）取材，将新鲜肝脏切成体积为24 mm×24 mm×2 mm小块。
（2）取出冷冻切片机中组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂（保证包埋充分没有气泡），迅速放于冷冻台上，冰冻，冰冻温度调至-17～-23℃，时间为3～5 min。
（3）将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，将组织修平。
（4）调好欲切的厚度，肝组织厚度取10～16μm。
（5）调好防卷板。应将防卷板调校到最佳位置，切片时，切片可以顺利到防卷板间的通道，舒展在持刀器的铁板上。最后掀起防卷板，迅速将其附贴于载玻片上。
2）HE染色步骤
95%酒精Ⅰ1 min→95%酒精Ⅱ1 min→自来水冲洗片刻→苏木素染色8 min→水洗→1%盐酸分化5 s→水洗→5%伊红酒精染色1 min→95%酒精Ⅰ1 min→95%酒精Ⅱ1 min→100%酒精Ⅰ1 min→100%酒精Ⅱ1 min→二甲苯Ⅰ1 min→二甲苯Ⅱ1 min→封胶→盖玻片→风干保存→镜下观察→显微摄影。
（五）指标测试与方法
1．体重与摄食量
体重测定方法：在实验大鼠清醒状态下，于每周五（该日不运动）使用电子秤测定大鼠体重，所有测定由一人操作读数。每日记录大鼠摄食量。
2．血脂（TC、TG、HDL、LDL）、肝脂（CHOL、TG）、肝功能（ALT、AST）测定
血脂、肝脂均采用比色法，在全自动分析生化仪上按试剂盒说明测定。
3．肝脏指数测定
肝脏指数（%）=（肝脏湿重量／体重）×100%
4．血清与肝脏FFA含量测定
血清与肝脏FFA测定采用比色法，在722分光光度计上按照试剂盒说明测定，试剂盒购于南京建成物工程研究所，具体操作步骤如下。
1）原理(https://www.daowen.com)
FFA能与铜离子结合形成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其含量与FFA含量成正比。
用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可推算出FFA的含量。
2）试剂组成与配制（50T）
（1）试剂一：液体，60 mL×4瓶，室温保存，极易挥发，于1个月内完成检测。
（2）试剂二：缓冲液，40 mL×1瓶，室温保存6个月。
（3）试剂三：铜试剂，甲液30 mL×1瓶，乙液30 mL×1瓶，丙液5 mL×1瓶，4℃保存6个月。
临用时以甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1混合配成铜试剂，需多少配多少，配好后4℃保存2周。
（4）试剂四：显色剂，粉剂×2支，稀释液10 mL×2瓶，4℃保存3个月。
临用时用1瓶10 mL稀释液溶解1支粉剂，配好后4℃可保存2周。
（5）试剂五：棕榈酸标准品粉剂×2支，溶剂50 mL×1瓶，4℃保存1个月。
1μmol/L棕榈酸标准品的配制：将一支粉剂用溶剂溶解后定容至20 mL，混匀（注意需用溶剂将装粉剂的小离心管洗净）。
（6）试剂六：双蒸水20 mL×1瓶（做空白管用）。
3）操作步骤
（1）实验仪器：玻璃试管，注射器，硬膜外麻醉针心针套，混匀器，移液器，离心机，分光光度计。
（2）分别取玻璃试管进行编号（最好用带盖的玻璃磨口试管进行实验，防止试剂发挥及更好的抽取）。
（3）操作表。
混匀，室温放置2 min，在440 nm、1 cm光径，试剂一调零比色。
4）计算公式
血清FFA含量（μmol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管浓度（1 000μmol/L）
（六）统计学处理
实验数据均采用平均数±标准差表示，所测定的结果用SPSS 23.0软件进行分析，采用单因素方差分析进行组间比较，实验前后比较用配对t检验，统计学显著性为P＜0.05，非常显著性为P＜0.01。
二、实验结果
（一）大鼠的一般情况
在实验过程中，C组大鼠体毛色光亮、较为活泼、体重逐渐增加。而H组大鼠体毛部分呈蜡黄色、杂乱无光泽，且嗜睡，活动减少，体重增速大。
（二）高脂饮食大鼠实验前后体重的变化
如表3-3、图3-1、表3-4、图3-2和图3-3所示，实验前两组大鼠的原始体重无显著性差异[（196.55±10.16）g对（199.32±9.02）g，P＞0.05] ；12周实验后，C组大鼠体重增长了226.27 g, H组大鼠体重增长了273 g, H组大鼠体重显著高于C组大鼠[553.79±51.84 g）对（422.82±15.49）g，P＜0.01]。
表3-3 实验期间大鼠体重变化（g）
注：与C组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与H组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与实验前比较，△P＜0.01.
图3-1 实验期间大鼠体重变化
表3-4 大鼠实验前后体重和平均增重（g）
注：与C组比较，∗P＜0.05.
图3-2 大鼠实验前后体重变化
图3-3 大鼠平均体重增重
（三）高脂饮食大鼠实验前后肝湿重和肝指数的变化
由表3-5和图3-4可知，与C组相比，H组大鼠肝湿重和肝指数均显著升高（P＜0.01）。
表3-5 大鼠实验前后肝湿重、肝脏指数（g）
注：与C组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01.
图3-4 大鼠实验前后肝湿重和肝脏指数比较
（四）高脂饮食大鼠血清FFA和血脂的变化
由表3-6、图3-5和图3-6可知，与C组相比，H组大鼠血清FFA、TC、TG、LDL均显著升高（P＜0.01），HDL有所下降，但无显著差异。
表3-6 大鼠血清FFA和血脂指标的比较（mmol/L）
注：与C组比较，∗∗P＜0.01.
图3-5 各组大鼠血清FFA比较
图3-6 各组大鼠血脂比较
（五）高脂饮食大鼠肝脏功能的变化
由表3-7和图3-7可知，与C组相比，H组大鼠ALT、AST均显著升高（P＜0.01）。
表3-7 大鼠肝脏功能的变化（U/L）
注：与C组比较，∗∗P＜0.01.
图3-7 大鼠肝脏功能的变化
（六）高脂饮食大鼠肝脏TG、TC和FFA的变化
由表3-8、图3-8和图3-9可知，与C组相比，H组大鼠肝脏TC、TG均显著升高（P＜0.01）。
表3-8 大鼠肝脏TC、TG和FFA的变化（μmol/mg prot）
注：与C组比较，∗∗P＜0.01.
图3-8 大鼠肝脏FFA的变化
图3-9 大鼠肝脏TC、TG的变化
（七）高脂饮食大鼠肝脏形态及肝组织的变化
1．肝组织观察
通过肉眼即可观察C组大鼠肝脏形态正常，呈红褐色，颜色明亮有光泽，切面光滑；H组大鼠肝脏体积明显增大，颜色呈黄中带白，边缘饱满，油腻感明显，刀切时易碎，刀面有脂肪沾染（图3-10）。
图3-10 各组大鼠肝脏组织比较（HE染色×200）
2．肝组织形态学观察
HE染色后，由图3-11可知，200倍光镜下观察结果显示：C组大鼠肝细胞无脂肪变性，中央静脉为中心发射状排列，肝小叶结构正常，细胞索排列整齐，肝窦间隙正常；H组大鼠肝细胞严重脂肪变，细胞核挤向边缘，肝小叶难以辨认，细胞肿胀，胞浆疏松且有较大空泡，有炎症浸润。
图3-11 各组大鼠肝组织形态学比较
三、讨论
采用动物模型进行实验研究是人们对于许多疾病进行研究探索的重要手段，而且是行之有效的手段。随着NAFL的发病率越来越高，人们对该病的研究也越来越深入，但是对其真正发病机制尚不清楚，目前，NAFL的模型建立在国内外已有很多报道，在众多的NAFL模型的建立中，高脂诱导的动物模型，因其简单方便、成本较低、造模成功率高，是国内外最常用的造模方法。本实验研究复制的脂肪肝模型是根据陈世清等报道的动物模型，对雄性SD大鼠进行12周长期高脂饮食，复制NAFL模型。
经过12周高脂饲料喂养后，正常对照组大鼠生长及生活状况正常，高脂饮食组大鼠食欲不振，毛色暗淡无光泽。组织取材后，肉眼观察正常组和高脂组大鼠肝脏，发现正常对照组的肝脏鲜艳的红褐色，有光泽；而高脂组大鼠肝脏明显增大，呈黄色，有油腻感。光镜下观察，正常对照组大鼠的肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，细胞核位于细胞中央，高脂饮食组大鼠肝细胞出现小泡和大泡性脂肪变，肝细胞肿胀，呈气球、水样变性。
除了其病理形态观察，本研究还测定了大鼠肝湿重、肝脏指数以及大鼠血液指标。结果显示，高脂饮食组大鼠肝湿重和肝指数与正常对照组相比均呈现非常显著的增加（P＜0.01），与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠血清TG、TC、FFA含量均高于正常对照组，差异非常显著（P＜0.01）。血液中ALT和AST增高是肝脏功能受到损害的间接表现，也是传统的判定肝功能损害的指标之一。本研究测定了血清ALT和AST的活性，结果显示高脂饮食大鼠血清ALT与AST均高于正常对照组，呈极显著差异（P＜0.01）。由此可见，通过12周高脂饮食，不仅会导致单纯性脂肪肝的形成，从而导致肝细胞受损，还可能会形成NASH，甚至往更严重的方向发展。
综上所述，12周的高脂饮食成功复制了NAFL大鼠模型。
（一）高脂饲料配方、动物品系及实验方案的选择制定
目前已知临床发病率较高的NAFL为高脂血症性脂肪肝，其次为肥胖性脂肪肝，而其他脂肪肝虽有发生，但不多见。目前建立NAFL实验模型采用的方法较多，包括直接给大鼠喂改良的CMDD饲料，给大鼠喂高胆固醇、高脂肪饲料后（含硫代乙酰胺）或灌以小剂量CCl4损伤肝脏，还有用脂肪乳灌胃法。因高脂饲料喂养形成的脂肪肝模型，其病理特征与人类相似，且价格低廉、方法简单，为此，当前开展对脂肪肝模型的方法学研究多以高脂饮食诱导的NAFL模型为理想的NAFL模型。目前研究NAFL模型采用配方是参照美国HarlanTeklad实验室的CMDD饲料配方改良。最常用的高脂饲料营养法，即在食物中加入较多的猪油、胆固醇和胆盐。因该方法模拟了居民饮食结构，造模虽时间长，但病变轻，有渐进性发展过程，因而是国内外实验室研究最常用的造模方法。有研究表明，高脂饲料（基础饲料加1%～2%胆固醇、10%猪油或5%蛋黄粉）喂养8～12周后，可形成中度至重度大泡性脂肪变，伴ALT增高。也有研究表明，用1%胆固醇、5%猪油、10%玉米油，大鼠自由饮水和进食。食用该高脂饲料3个月时出现轻度肝脂肪变性，体重显著高于正常组。6个月时脂肪肝进展为中度，但未出现肝纤维化，肝组织内TG的含量显著高于正常对照组。
可供选择的实验动物模型种类很多，常见的高脂诱导的模型动物主要有小鼠、大鼠、鹌鹑、家兔等，常选用雄性Wistar或SD大鼠为造模模型。SD大鼠造模时间短，效果好，有明显的遗传背景，便于饲养，类似人类因膳食结构改变而形成的高脂血症。
因此，本实验采用12周高脂饲料喂养SD大鼠，以观察高脂饲料构建NAFL模型的效果。
（二）高脂饮食对大鼠体重和肝脏指数的影响
在本实验中，实验组与对照组大鼠除饲料配方不同以外，摄食量无显著差异。实验前，各组大鼠体重无显著性差异；12周建模实验中，各组大鼠生长发育良好，体重均稳步增长直至最后。H组大鼠体重从第5开始显著高于C组，并持续至实验末。H组大鼠体重增加显著快于C组，说明高脂饮食可造成大鼠体重迅速增加。这与建模组高脂、高胆固醇饲料的总热量显著高于C组饲料有关。长期高热量饮食导致脂肪在细胞内聚集，胆固醇和胆盐可导致细胞内发生过氧化反应，会加速NAFL形成。本实验中，高脂饮食组大鼠体重的变化表明，高脂喂养12周可形成NAFL大鼠的体重特征。
12周高脂饮食喂养后，高脂饮食模型组大鼠的肝湿重和肝指数都显著高于正常对照组大鼠。这与建模组大鼠高热量饮食导致体重指数、肝脏指数均增加相关。此项指标的增加，与其他研究中建模评价标准一致。
（三）高脂饮食对大鼠肝脏的形态学影响
高脂饮食后，食物中的脂肪被肠黏膜吸收后，以乳糜微粒的形式进入到血循环，把脂肪运至脂肪组织，并以TG的形式保存。肾上腺素、糖皮质等激素等可以激活激素敏感脂肪酶，使脂肪组织以FFA的形式释放脂肪并运输到肝脏。因此长期高脂饮食后，肝脏会有大量脂质堆积。本实验通过HE染色，观察了高脂饮食大鼠的肝脏形态，结果显示无论是肝脏形状特征还是组织学的HE染色观察，高脂饮食组大鼠肝脏体积增大、色泽土黄、刀切有油腻感，光镜下观察肝组织切片肝细胞肿胀，核被挤向边缘，呈气球样、水样变性。胞浆内有大小不等的空泡，可能为脂肪滴溶解所致，并以大泡性为主，肝小叶难以辨认。因此，从形态学的改变，初步判断12周高脂饮食已诱导大鼠形成脂肪肝。
（四）高脂饮食对大鼠脂代谢和肝功能的影响
FFA是脂肪代谢的产物，是机体主要的功能物质之一。当脂肪动员时，储存于脂肪细胞中的TG被一系列脂肪酶，如TG脂肪酶水解为甘油和FFA并释放入血供全身各组织利用。因而血中的FFA是脂肪代谢的中间产物，可为心脏、肝脏和骨骼肌等器官提供能量。本实验中，通过对高脂组SD大鼠进行12周的高脂饲料喂养后发现，高脂组大鼠血清FFA明显高于C组，这可能是由于高脂饮食大鼠摄入脂肪含量更多，大鼠体内脂肪细胞数量增多，当脂肪动员时，其内的TG通过脂解产生的FFA过剩，这部分FFA释放入血而使血清FFA含量增高。血清FFA是脂肪酸在血液中的运输形式，以清蛋白作为脂肪酸的载体，FFA可经血液运输至肝脏，而后在肝脏线粒体内进行β-氧化，因此肝脏是进行脂肪酸氧化最活跃的器官。本研究结果也证实了在高脂饮食模型组大鼠肝脏中，FFA水平显著升高。
NAFL与高血脂密切相关。由于肝脏功能的复杂性，可调节人体血脂、血糖、蛋白合成和转化，单一指标不适合作为判断标准，因此将肝功能和血脂作为早期脂肪肝的敏感指标。本研究结果显示，12周高脂饮食喂养后，高脂饮食模型组大鼠血清和肝脏的TC、TG，肝功能指标ALT、AST与C组相比均有显著性差异，说明高脂饮食喂养可提高大鼠血清和肝脏ALT、AST、TC、TG、LDL水平，这与前人的研究结果一致。TC、TG的升高，说明长期高脂饮食会加速脂质合成，尤其是TC在肝脏的沉积；而TC合成率可能高于分解率，进而导致TG、LDL含量相对于升高。研究表明，AST约4/5存在于肝细胞线粒体中，轻微损伤时AST数值升高不明显；当AST数值升高明显，说明12周高脂饲料喂养，不仅会导致单纯性脂肪肝的形成，还会导致大鼠肝脏细胞器受损。
四、结论
12周高脂饮食喂养成功建立了大鼠NAFL动物模型。