不同时间游泳运动治疗高脂饮食大鼠非酒精性脂肪肝形成的机制研究

第三节　不同时间游泳运动治疗高脂饮食大鼠非酒精性脂肪肝形成的机制研究

本章第二节的研究已表明，运动对高脂饮食大鼠有预防NAFL形成的作用，目前尚无特效药物。近些年来，对NAFL患者全面实施综合干预，通过饮食调节和运动来降低体重是最有效的治疗方法。运动防治NAFL的发生是临床医学和运动医学领域研究的重要课题之一。目前研究成果均显示运动疗法对治疗NAFL有明显效果，但有效率报道上有较大差异。运动疗法对轻度、中度NAFL疗效较为显著，对重度NAFL的效果不如前两者明显，其机制尚无专门研究。运动处方实施缺乏。目前对运动处方的研究相对较少，且缺乏实验性研究。运动项目、运动强度、运动量等标准的设置上缺乏实验性结论的支持。虽然研究结果尚不完全一致，但是至少可以为临床预防和治疗NAFL提供了一条新的途径和思路。本实验通过12周高脂配方饲料喂养SD大鼠以诱导大鼠产生NAFL，同时进行不同的游泳运动干预，观察不同时间游泳运动对高脂饮食大鼠NAFL的影响。

一、材料与方法

（一）实验仪器

电子分析天平　北京赛多利斯仪器系统有限公司

5810R型高速低温离心机　德国Epp endorf公司

IKA-T10basic匀浆机　德国IKA公司

微量加样器　德国Epp endorf公司

MILLI-Q纯水机　美国Millipore公司

超低温冰箱（-80℃）　Thermo公司

AF100AS冰冻切片机　Scotsman Frimont公司

高压灭菌锅　Tomy Kogyo公司

电热鼓风干燥箱　上海精宏实验设备有限公司

Bio-rad电泳和电转移装置　美国Bio-Rad公司

凝胶图像处理系统　美国Dophin公司

（二）实验试剂

血清游离脂肪酸试剂盒　南京建成生物工程研究所

甘油三酯试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

总胆固醇试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

高密度脂蛋白胆固醇试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

低密度脂蛋白胆固醇试剂盒　北京北化康泰临床试剂有限公司

油红试剂、HE试剂　南京建成生物工程研究所

BCA蛋白定量试剂盒　Thermo公司

兔抗大鼠兔抗大鼠PPARα、SREBP-1c、

SCD-1单克隆抗体　CST公司

兔抗大鼠AMPK单克隆抗体　CST公司

小鼠抗大鼠p Akt^Ser473磷酸化多克隆抗体　CST公司

小鼠抗大鼠Akt多克隆抗体　CST公司

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG　上海康成生物工程有限公司

RIPA裂解液（强）　碧云天生物技术研究所

PMSF　上海索莱宝生物科技有限公司

4×上样缓冲液　上海索莱宝生物科技有限公司

Protein Marker　Ferments公司

十二烷基磺酸钠（SDS）　Sigma公司

过硫酸铵（NH₄）₂ S₂ O₈　Amresco公司

Tris Base, SDS，丙烯酰胺，Glycine等　Ferments公司

脱脂奶粉　光明乳业有限公司

滤纸　碧云天生物技术研究所

PVDF膜　Ferments公司

ECL化学发光液　Thermo公司

其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

主要试剂配制：

（1）0.01 mM PBS溶液：

KCl 0.2 g

KH₂ PO₄ 0.24 g

Na₂ HPO₄ 1.44 g

NaCl 8 g

溶于800 mL超纯水中，用HCl调节溶液的p H至7.4，加入超纯水定容至1 000 mL，高压灭菌后，分装保存于室温或4℃冰箱中。

（2）75%乙醇：

无水乙醇75 mL

超纯水25 mL

室温保存。

（3）0.5 mol/L Tris-HCl（p H 6.8）：

Tris 10.06 g

超纯水80 mL

溶解后用浓盐酸调节p H至6.8，加入超纯水定容至100 mL，室温保存。

（4）1.5 mol/L Tris-HCl（p H8.8）：

Tris 20.28 g

超纯水80 mL

溶解后用浓盐酸调节p H至8.8，加入超纯水定容至100 mL，室温保存。

（5）1.0 mol/L Tris-HCl（p H6.8）：

Tris 30.29 g

超纯水200 mL

溶解后，用浓盐酸调节p H至6.8，加入超纯水定容至250 mL，室温下保存。

（6）30%丙烯酰胺：

丙烯酰胺（Acr）14.5 g

N, N-亚甲双丙烯酰胺（Bic）0.5 g

超纯水定容至50 mL

置于棕色瓶中避光存放于4℃冰箱中，最长可存放1个月。

（7）10%过硫酸胺：

过硫酸胺0.1 g

超纯水1.0 mL

溶解后，4℃保存，保存时间为1周

（8）10%SDS：

SDS 10 g

超纯水定容至100 mL，50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，可水浴溶化后使用。

（9）10 mmol/L PMSF：

PMSF 0.174 g

异丙醇100 mL

溶解后，-20℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/mL。

（10）20%Tween20

Tween20 20 mL

超纯水定容至100 mL，混匀后4℃保存。

（11）电泳液缓冲液：

Tris 3.03 g

甘氨酸18.77 g

SDS 1 g

超纯水定容至1 000 mL，溶解后室温保存。

（12）转膜缓冲液：

甘氨酸14.42 g

Tris 3.03 g

甲醇200 mL

超纯水定容至1 000 mL，溶解后室温保存。

（13）TBST缓冲液：

1 mol/L Tris-HCl（p H 7.5）10 mL

NaCl 8.8 g

Tween20 1 mL

超纯水定容至1 000 mL，高压灭菌后分装，室温下保存。

（14）封闭液：

BD脱脂奶粉5 g

TBST 100 mL(https://www.daowen.com)

现用现配。

（三）动物模型的建立

1．实验动物和喂养

6周龄SD纯系雄性大鼠70只，体重（200±20）g，购于南京鹏昇生物科技有限公司。所有大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机分为7组：普通饲料对照组（C组）、高脂饮食对照一组（H1组）、高脂饮食+60 min运动预防组（HE60-1组）、高脂饮食+90 min运动预防组（HE90-1组）、高脂饮食对照二组（H2组）、高脂饮食+60 min运动治疗组（HE60-2组）、高脂饮食+90 min运动治疗组（HE90-2组），每组各10只。根据实验分组要求，分组后的大鼠，C组大鼠给予普通饲料喂养，其他各组大鼠给予高脂饲料喂养。高脂饲料在低温冰箱保存，喂饲前常温复温。C组、H1组、HE60-1组、HE90-1组持续喂养12周。H2组、HE60-2组和HE90-2组大鼠持续喂养至20周。

2．实验动物分组和运动方案

H2组、HE60-2组和HE90-2组大鼠第1～12周不运动，第13～20周分别进行每天60 min和90 min、每天1次、每周6天的无负重游泳运动。具体运动时间安排见表3-22。

游泳缸内壁光滑，体积为100 cm×70 cm×60 cm，水深50 cm，水温（30±1）℃。运动时注意大鼠的状态，以防止溺水死亡，并及时捞出老鼠粪便，以保持游泳池的清洁。第20周游泳结束后，没有大鼠溺水死亡。训练时间安排在上午进行。整个喂养过程中，H2组大鼠无损失，运动组大鼠有溺亡，最终纳入统计的各组大鼠为8只，共24只。

（四）动物取材

1．取材方法

高脂饲料喂养20周结束，H2组在取材前一天禁食12 h，自由饮水。取材器械均经过高压灭菌消毒并高温（200℃）烘烤6 h。腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg），麻醉后，腹主动脉采血8 mL，4℃冰水中静置20 min，4℃离心（3 500 rpm）15 min，取血清，-30℃保存备用。

完整剥离肝脏，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，电子天平称重，记录肝湿重数据。取部分肝右叶组织，放于经0.1%DEPC处理的无RNA污染的去离子水中，漂洗去血渍。在冰浴条件下，取新鲜组织，进行冰冻切片。取少许肝右叶组织，按照1∶9（W/V）的比例加入4℃生理盐水，制备10%肝组织匀浆，然后在冰浴中进行手工匀浆，匀浆液4℃离心（12 000 rp m）15 min，取上清，-30℃保存，待测肝脏生化指标。切取肝右叶约200 mg放入液氮冻存管，投入液氮罐中保存备用。

2．切片制作

新鲜组织当天进行冷冻切片，常规HE染色，光学显微镜下观察肝组织形态学变化。

1）冷冻切片步骤

（1）取材，将新鲜肝脏切成体积为24 mm×24 mm×2 mm的小块。

（2）取出冷冻切片机中组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂（保证包埋充分没有气泡），迅速放于冷冻台上，冰冻，冰冻温度调至-17～-23℃左右，时间为3～5 min。

（3）将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，将组织修平。

（4）调好欲切的厚度，肝组织厚度取10～16μm。

（5）调好防卷板。应将防卷板调校到最佳位置，切片时，切片可以顺利到防卷板间的通道，舒展在持刀器的铁板上。最后掀起防卷板，迅速将其附贴于载玻片上。

2）HE染色步骤

95%酒精Ⅰ1 min→95%酒精Ⅱ1 min→自来水冲洗片刻→苏木素染色8 min→水洗→1%盐酸分化5sec→水洗→5%伊红酒精染色1 min→95%酒精Ⅰ1 min→95%酒精Ⅱ1 min→100%酒精Ⅰ1 min→100%酒精Ⅱ1 min→二甲苯Ⅰ1 min→二甲苯Ⅱ1 min→封胶→盖玻片→风干保存→镜下观察→显微摄影。

（五）指标测试与方法

1．体重与摄食量

体重测定方法：在实验大鼠清醒状态下，于每周五（该日不运动）使用电子秤测定大鼠体重，所有测定由一人操作读数。每日记录大鼠摄食量。

2．血脂（ALT、AST、GLU、CHOL、TC、TG、HDL、LDL）、肝脂（CHOL、TG）测定

血脂、肝脂均采用比色法，在全自动分析生化仪上按试剂盒说明测定。

3．肝脏指数测定

肝脏指数（%）=（肝脏湿重量／体重）×100%

4．血清与肝脏FFA含量测定

血清与肝脏FFA测定采用比色法，在722分光光度计上按照试剂盒说明测定，试剂盒购于南京建成物工程研究所，具体操作步骤如下。

1）原理

FFA能与铜离子结合形成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其含量与FFA含量成正比。用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可推算出FFA的含量。

2）试剂组成与配制（50T）

（1）试剂一：液体，60 mL×4瓶，室温保存，极易挥发，请于1个月内完成检测。

（2）试剂二：缓冲液，40 mL×1瓶，室温保存6个月。

（3）试剂三：铜试剂，甲液30 mL×1瓶，乙液30 mL×1瓶，丙液5 mL×1瓶，4℃保存6个月。

临用时以甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1混合配成铜试剂，需多少配多少，配好后4℃保存2周。

（4）试剂四：显色剂，粉剂×2支，稀释液10 mL×2瓶，4℃保存3个月。

临用时用1瓶10 mL稀释液溶解1支粉剂，配好后4℃可保存2周。

（5）试剂五：棕榈酸标准品粉剂×2支，溶剂50 mL×1瓶，4℃保存1个月。

1μmol/L棕榈酸标准品的配制：将一支粉剂用溶剂溶解后定容至20 mL，混匀（注意需用溶剂将装粉剂的小离心管洗净）。

（6）试剂六：双蒸水20 mL×1瓶（做空白管用）

3）操作步骤

（1）实验仪器：玻璃试管，注射器，硬膜外麻醉针心针套，混匀器，移液器，离心机，分光光度计。

（2）分别取玻璃试管进行编号（最好用带盖的玻璃磨口试管进行实验，防止试剂发挥及更好的抽取）。

（3）操作表。

充分混匀抽提2 min，3 500 rp m离心10 min，仔细吸去上层蓝色液体及蛋白凝块弃之，吸取下层抽提液2 mL进行显色。

混匀，室温放置2 min，在440 nm、1 cm光径，试剂一调零比色。

4）计算公式

血清FFA含量（μmol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管浓度（1 000μmol/L）

5．肝脏组织总RNA的提取

同本章第二节。

6．实时荧光定量PCR测定大鼠骨骼肌PPARα、SREBP-1c和SCD-1 mRNA的表达量

同本章第二节。

7．肝脏组织p Akt^Ser473磷酸化水平、Akt、AMPK、PPARα、SREBP-1c和SCD-1蛋白表达水平的测定

同本章第二节。

（六）统计学处理

实验数据均采用平均数±标准误表示，所测定的结果用SPSS 17.0软件进行分析，采用单因素方差分析进行组间比较，实验前后比较用配对t检验，统计学显著性为P＜0.05，非常显著性为P＜0.01，具有统计学意义。

二、实验结果

（一）大鼠的一般生长情况

在实验过程中，H2组大鼠体毛部分呈蜡黄色、杂乱无光泽，嗜睡，活动减少，体重增速大。与H2组相比，HE60-2组和HE90-2组大鼠体毛较干净，精神状态很好，较活泼。

（二）NAFL大鼠实验前后体重的变化

游泳处理前、游泳处理后5、6、7、8、9、10周后，H2组、HE60-2组、HE90-2组间的大鼠体重无显著差异（P＞0.05）；游泳6周后，HE60-2和HE90-2组大鼠的体重显著低于H2组（P＜0.05）；游泳处理2、13周后，HE60-2组的大鼠显著低于H2组（P＜0.05）；游泳处理后12～16周后，HE90-2组的大鼠体重均极显著低于H2组（P＜0.01）；游泳处理后14～16周，HE60-2组大鼠体重均极显著低于H2组（P＜0.01）；16周后，H2组、HE60-2组、HE90-2组的大鼠体重均极显著高于基础体重（表3-23，表3-24，图3-28，图3-29，图3-30）。

（三）NAFL大鼠肝湿重和肝指数的变化

表3-25和图3-31显示，20周实验后，HE90-2组大鼠的肝湿重显著低于H2组（P＜0.05），HE60-2和HE90-2间的肝湿重不存在显著差异（P＞0.05）。

（四）运动对NAFL大鼠血清FFA和血脂的影响

由表3-26、图3-32和图3-33可知，HE90-2组的TC、TG、FFA都极显著低于H2组（P＜0.01）；HE60-2和HE90-2间的TC、TG、HDL、LDL、FFA均无显著差异（P＞0.05）。

（五）运动对NAFL大鼠肝脏功能的影响

由表3-27和图3-34可知，HE60-2组及HE90-2组的ALT、AST水平都极显著低于H组（P＜0.01），HE90-2组的ALT水平极显著低于HE60-2组（P＜0.05），但是HE90-2组和HE60-2组间的AST水平却不存在显著差异（P＞0.05）。

（六）运动对NAFL大鼠肝脏TG、TC和FFA的影响

由表3-28、图3-35和图3-36可知，HE60-2组TC水平显著低于H2组（P＜0.05），HE90-2组TC水平显著低于H2组（P＜0.01），HE90-2组的TG水平极显著低于H2组（P＜0.01），HE60-2组和HE90-2组的FFA水平极显著低于H2组（P＜0.01）。

（七）高脂饮食NAFL大鼠肝脏形态及肝组织的变化

1．肝组织观察

如图3-37所示，H2组大鼠肝脏体积明显增大，颜色呈浅黄色或土黄色，边缘饱满，刀切时易碎，刀面有脂肪沾染；HE60-2组大鼠肝脏与H2组相比，体积明显减小，颜色呈浅黄褐色，刀切时脂肪沾染少；HE90-2组肝脏与H2组比，颜色偏红褐色，刀切时脂肪沾染极少。

2．NAFL大鼠肝组织形态学观察

如图3-38所示：光镜下，H2组大鼠肝细胞严重脂肪变，细胞核挤向边缘，肝小叶难以辨认，细胞肿胀，胞浆疏松且有较大空泡，有炎症浸润；HE60-2组大鼠肝细胞见轻度脂肪变，部分肝索排列紊乱，胞浆内有大小不等的脂肪滴；HE90-2组大鼠肝细胞基本上是以中央静脉为中心呈放射状排列，偶见微量小泡性脂肪滴，与正常肝脏最为接近。

（八）运动对NAFL大鼠Akt蛋白表达水平的影响

由表3-29和图3-39可知，与H2组相比，HE60-2和HE90-2组大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平显著提高（P＜0.05，P＜0.01）。但HE60-1和HE90-1组大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平组间无显著性差异。

（九）运动对NAFL大鼠AMPKα蛋白表达水平的影响

由表3-30和图3-40可知，与H2组相比，HE60-2和HE90-2组大鼠肝脏AMPK蛋白表达水平显著提高（P＜0.01）。但HE60-2和HE90-2组大鼠肝脏AMPK蛋白表达水平组间无显著性差异。

（十）运动对NAFL大鼠SREBP-1c、SCD-1、PPARα表达水平的影响

由表3-31、表3-32、图3-41和图3-42可知，，与H2比较，HE60-2组和HE90-2组大鼠肝脏SREBP-1c、SCD-1均显著下降（P＜0.05或P＜0.01），而PPARα的mRNA和蛋白表达量均显著增加（P＜0.05），且三组间SREBP-1c、SCD-1和PPARα的mRNA及蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。

三、讨论

NAFL的特点是脂肪堆积在肝细胞中，在光镜下细胞质内有很多小脂肪滴。NAFL的发病机制尚未被很好地阐释，且NAFL的治疗仍存在争议。除了持续的体重减轻，没有其他单方面干预有明确的显著统计学意义的疗效。运动已被报道对脂质代谢具有显著的效果。一些研究表明，通过运动干预，脂肪组织和肝脏脂肪积累显著减少，脂肪酸在骨骼肌的氧化显著提高，血脂显著下降。所有这些良性效应都支持了这一假设：运动对脂肪肝的干预是有作用的。然而，具体涉及可能的机制还是一个未知数。在本研究中，我们借助于给予大鼠喂食高脂肪的膳食，建立NAFL模型从而研究不同运动方案是否能治疗NAFL，探讨其可能的干预机制。

（一）不同运动方案对NAFL大鼠体重的影响

本实验中，各组大鼠体重均稳步增长，提示大鼠生长发育良好，运动组大鼠运动量适宜。H2组体重从第1周即有显著增高，并持续至实验末，实验期间增重也是三组中最快的。三组大鼠平均增重排序为H2＞HE60-2＞HE90-2。说明高脂饮食造成了大鼠体重迅速增长。本实验中，两高脂运动组大鼠体重均较高脂安静组非常显著性降低，整个实验期间平均体重增长亦略为缓慢，说明运动抑制了大鼠摄入能量，通过减缓体重增长速度发挥了其控制体重的作用。HE60-2组与HE90-2组之间，尤以HE90-2组体重最轻及体重增长最为缓慢，说明同样的运动方式下，高脂膳食可部分抵消运动控制体重的良性效应。

（二）不同运动方案对NAFL大鼠脂肪肝的治疗作用

1．运动对高脂饮食大鼠脂肪肝形成的形态学观察

从本实验结果可以看出，经过8周不同时间的运动干预，高脂饮食大鼠肝脏无论在肉眼下观察其形态特征还是HE染色在电镜下进行病理学观察，都能够发现，在组织形态学上，单纯高脂饮食大鼠肝脏具有典型的脂肪变，表现为气球样变性以及脂肪滴，提示NAFL模型成功建立。而高脂饮食60 min和90 min运动组大鼠肝脏比单纯高脂饮食组的大鼠肝脏有明显的改善：高脂饮食组大鼠肝脏体积增大，呈土黄色，刀切有油腻感，肝细胞发生脂肪变，细胞核挤向边缘，肝小叶已难以辨认，细胞呈现出肿胀，胞浆疏松且有较大空泡，有炎症浸润；高脂饮食60 min游泳运动组大鼠肝细胞见轻度脂肪变性，部分肝索排列紊乱，胞浆内有大小不等的脂肪滴；高脂饮食90 min游泳运动组大鼠肝细胞也表现出有轻微脂肪变性，偶见微量小泡性脂肪滴。实验研究证明，高脂饮食可引起肝脏脂肪变性，运动作为一种有效的干预手段对高脂饮食大鼠脂肪肝的治疗有一定的良性作用，这与前人的研究结果相一致。

2．不同运动方案对NAFL大鼠脂质代谢及肝功能的影响

脂代谢紊乱被普遍认为是NAFL的根本。已有研究证实FFA浓度升高或细胞内脂肪含量增多可引起或加重IR和胰岛β细胞功能损害，启动或促进2型糖尿病的发病，即所谓“脂毒性”学说。FFA是脂肪酸从储存部位脂肪组织转运到肝脏和肌肉等组织利用的形式。不属于传统脂蛋白范畴。主要由皮下和内脏脂肪脂解产生，其升高和降低主要受激素敏感性脂肪酶（HSL）和脂蛋白脂酶（LPL）调节。肝脏中约15%的FFA来自膳食脂。过量的脂肪摄入可增加血液FFA。而碳水化合物，尤其是果糖摄入过多，可显著刺激脂肪酸的从头合成作用。超重和肥胖是NAFL发生发展的主要因素，肥胖人群的脂肪组织的胰岛素敏感性降低，脂肪分解作用加强，导致生成大量FFA，而肝脏内过多的FFA是NAFL早期发生发展的主要原因。此外，在胰岛素抵抗状态下发现体内胰岛素增加，减少肝脏内脂蛋白的合成，同时增加肝脏内脂肪酸的合成。这样导致的结果是TG生成增加并在肝脏内蓄积。血清TG主要来源于机体摄入的葡萄糖和脂肪。脂肪组织内TG分解增加，进而升高血液中FFA水平。肝细胞通过脂肪酸转运体对膳食来源和脂肪分解产生的FFA摄取增加。大部分肝脏TG（约2/3）来自脂肪分解生成的血液FFA。运动对血清TG的影响与运动量、强度及持续时间有关。多数研究显示，运动后血清TG明显下降。运动时，由于肌肉储存的TG被消耗，促进内皮细胞中脂蛋白脂肪酶（LPL）合成，脂肪组织LPL活性和血清LPL水平升高，使TG和富含TG的脂蛋白代谢加速，导致血清TG水平下降，同时也使血清LDL水平下降。本研究结果证明了无论是60 min游泳运动还是90 min游泳运动，均能够降低NAFL大鼠血清FFA和血脂水平，增加肝脏脂代谢，减少肝脏脂质沉积，同时NAFL大鼠肝功能较高脂不运动大鼠也有显著改善。说明8周游泳运动能够有效治疗高脂饮食造成的NAFL。这与前人研究结果一致。

（三）运动治疗高脂饮食大鼠NAFL的机制分析

1．不同运动方案对高脂饮食大鼠肝脏Akt的影响

研究发现，FFA水平升高可通过炎症因子的分泌增加而降低Akt磷酸化水平，从而抑制Akt活性后阻碍细胞相关信号转导途径。在第二节中，我们已经证明了高脂饮食大鼠肝脏细胞PI3K/Akt信号转导存在异常。在本实验中，为了验证运动治疗NAFL过程中，运动对PI3K/Akt信号的良性作用，我们用Western Blot检测了Akt^Ser473磷酸化水平和Akt蛋白表达。结果表明，与NAFL大鼠相比，运动组大鼠肝脏Akt^Ser473磷酸化水平显著增加，说明运动可改善NAFL大鼠肝脏Akt信号传导。

2．不同运动方案对高脂饮食大鼠肝脏AMPK的影响

研究表明，AMPK可增加脂肪酸的氧化，减少TG合成。AMPK通路可在细胞和组织水平调节能量稳态。AMPK对AMP/ATP比变化敏感，可作为胞内能量水平的传感器。在空腹、能量限制和增加ATP损耗状况下，AMPK及其上游的激酶激活。研究显示，在高脂喂养和正常喂养的小鼠体内，AMPK的慢性激活可限制TG蓄积：Buhl等给自发性IR肥胖Zucker大鼠皮下注射AICAR，结果发现，肥胖大鼠TG、FFA、腹部脂肪含量明显减少；HDL-C水平升高，提示激活AMPK可有效改善脂质代谢紊乱。还有研究认为，高脂饮食后，NAFL大鼠肝脏AMPKα的蛋白表达水平显著降低，而60 min和90 min游泳运动均显著提高了NAFL大鼠肝脏AMPKα的蛋白表达水平。说明AMPK的活化在运动改善NAFL大鼠肝脏脂质堆积中发挥了重要作用。

3．不同运动方案对高脂饮食大鼠肝脏PPARα、SREBP-1c和SCD-1表达水平的影响

目前关于运动对PPARα的研究越来越多，已有证据表明，运动训练可提高肝脏PPARα的表达水平。6周游泳训练可以提高肥胖大鼠肝脏PPARα的mRNA以及其调控的参与FFA氧化的各种酶的基因表达。张海峰的游泳训练对NAFL的研究也证明，适宜的运动可提高NAFL大鼠肝脏PPARα的mRNA表达量。李竞丽的研究结果也证实了60 min和90 min游泳运动训练增加了高脂饮食大鼠肝脏PPARα的mRNA和蛋白的表达水平。研究发现，转录因子SREBP-1c已被确定为AMPK的重要靶标。AMPK的活化，使SREBP-1c的基因表达下调，最终可抑制脂质合成。SREBP-1c是SREBP-1在肝中表达的主要异构体，并调节成脂基因的表达，更侧重于增强肝内包括SCD-1在内的有关脂肪酸合成必需基因的转录。但是目前关于SREBP-1c的表达水平与NAFL的相关性，相关研究报道并不太一致。陆元善等的研究认为SREBP-1c表达水平下降可使肝细胞内SCD-1转录降低，血浆FFA增加，肝内多余的脂肪不能重新酯化并装配成VLDL排出，脂质在肝内沉积。高燕翔等的研究发现，在NAFL大鼠肝脏中，SREBP-1c过度活跃，呈现高水平表达状态。我们的实验研究表明，高脂饮食喂养可成功地塑造NAFL模型大鼠，肝脏PPARα的mRNA和蛋白表达水平显著减少，SREBP-1c表达显著增加，同时SCD-1表达水平也显著增加。而运动干预后的NAFL大鼠肝脏PPARα的mRNA和蛋白表达水平显著增加，肝脏SREBP-1c和SCD-1的mRNA和蛋白表达水平均显著下降，说明60 min游泳运动和90 min游泳运动均能显著影响NAFL大鼠肝脏脂肪酸代谢相关基因PPARα、SREBP-1c和SCD-1的表达。我们分析，这可能是由于在肝脏中，运动激活了AMPKα导致p70S6K1磷酸化及活化水平降低，减少肝脏X受体（liver X receptor, LXR）磷酸化，使LXR与SREBP-1c上游的LXR结合元件的结合减少，最终导致SREBP-1c表达量减少，降低SCD1的表达，从而减少肝脏的脂质合成。此外当肝脏中AMPKα活性增加时，可以抑制SREBP-1c活性后阻止下游靶基因——FAS、ACC以及SCD1等与脂质合成相关的关键酶，有效减少肝脏TG合成及脂质沉积。还有研究表明，SCD-1在高脂饮食引起的NAFL的形成和治疗中起中枢调节作用，提示SCD-1有望成为临床NAFL的预防的一个较为合适的监测指标。

4．运动在治疗高脂饮食大鼠肝脏NAFL中的作用及机制

NAFL的特点是肝细胞中脂肪的过度堆积，在光镜下细胞质内有很多小脂肪滴。迄今为止，NAFL的发病机制尚未完全阐明，且关于NAFL的治疗仍存在争议。尽管已有研究表明，运动干预减少了肝脏的脂肪积累，提高了脂肪酸的氧化，并降低了血脂。然而，其可能的机制仍需进一步研究和阐释。在本研究中，我们研究了运动是否能治疗NAFL，探讨了可能的机制。我们通过喂食高脂肪饲料，建立了NAFL大鼠动物模型。结合肝脏组织形态学结果和血脂及肝脂的检测结果，提示成功建立NAFL模型。

在本研究中，我们发现，60 min和90 min游泳运动干预降低了TG在肝脏中的沉积。组织形态学分析的评估提示，这两种运动方案均在治疗高脂饮食大鼠脂肪肝过程中改善NAFL。形态学观察是脂肪肝半定量的“分级”评价，定量化脂肪是一个比较客观和准确的判断肝组织中脂肪含量的方法。因此，我们还使用分光光度法检测了NAFL大鼠肝脏TG的水平，结果证明了运动促进脂质代谢的效果。

接着，我们探索了运动治疗NAFL的分子机制。研究结果表明，运动可有效治疗NAFL大鼠脂肪肝，这可能是由于运动促进了PI3K/Akt信号转导，从而活化AMPK后抑制了脂质合成的进程，并降低TG在肝脏中的积聚。8周60 min和90 min游泳运动提高了NAFL大鼠肝脏内AMPKα的蛋白表达水平，激活了AMPK信号通路，抑制了SREBP-1c/SCD-1的表达，减少肝脏脂质合成。另外也有研究证实，长期有氧运动可增加小鼠肝脏Akt的磷酸化水平，增加肝脏mTOR的蛋白表达水平，继而通过降低SREBP-1c/SCD-1的表达，从而减少肝脏脂质合成。但运动干预对肝脏脂质代谢的影响受到运动方式、运动强度和运动时间等要素的影响，而现有研究对于运动强度和方式的选择尚存在一定的争议。本研究结果也证实：运动后，NAFL大鼠肝脏脂质堆积有显著减少，肝脏Akt蛋白、AMPKα蛋白表达水平均增加，肝脏脂肪代谢相关基因PPARα表达水平显著提高，SREBP-1c和SCD-1表达发生显著下调，说明运动可增强NAFL大鼠肝脏PI3K/Akt信号转导，从而激活AMPK通路。一方面，AMPK可能直接通过抑制PPARα或SREBP-1c的表达水平而促进NAFL大鼠肝脏脂质的代谢；另一方面，AMPK可能通过mTOR的介导作用，间接影响NAFL大鼠脂质代谢：①通过下调肝脏mTOR的表达水，促进肝脏PPARα的表达，从而促进NAFL大鼠肝脏脂质代谢；②通过下调肝脏mTOR的表达水平，抑制SREBP-1c的表达，进而减少SCD-1的生成，从而抑制NAFL大鼠肝脏脂质合成。

四、结论

8周60 min游泳运动和90 min游泳运动均可有效治疗NAFL大鼠脂肪肝，其机制可能是：①游泳运动可增强NAFL大鼠肝脏PI3K/Akt信号转导，从而激活AMPK，通过AMPK信号通路直接抑制肝脏PPARα或SREBP-1c表达水平，从而促进NAFL大鼠肝脏脂质的代谢，最终治疗NAFL大鼠脂肪肝；②游泳运动可增强NAFL大鼠肝脏PI3K/Akt信号转导，增强AMPK蛋白表达，抑制肝脏mTOR的表达，间接影响NAFL大鼠脂质代谢。mTOR的表达受抑制后，一方面可促进肝脏PPARα的表达，从而促进NAFL大鼠肝脏脂质代谢；另一方面可抑制肝脏SREBP-1c的表达，进而减少SCD-1的生成，从而抑制肝脏脂质合成，最终能够有效治疗NAFL大鼠脂肪肝成。但在运动治疗NAFL大鼠脂肪肝的干预效果中，这两种不同的游泳方案无显著差异。