第一节 概 述
胰腺癌是目前预后最差的消化道肿瘤，其病死率与发病率接近。虽然胰腺癌的研究取得了重要进展，但其预后仍很差，学者们仍在寻找新的治疗方法。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）学说的提出为寻找根治胰腺癌的方法提供了新的理论基础。该学说认为，在实体瘤或体外细胞系中存在的极少数细胞具有自我更新和多分化潜能，可能在肿瘤的发生发展以及放、化疗耐药中起到重要作用。目前，胰腺癌干细胞（pancreatic cancer stem cell，PCSC）已被证实具有自我更新、高致瘤性、活跃分化潜能和强耐药性的特点，具有极高的恶性程度。
一、PCSC发展简史
早在150年前，病理学家Connnheim和Duramte就提出，组织中存在的极少数干细胞可能是肿瘤的起始细胞。
1994年，Lapidot等首次通过特异细胞表面标志分离出人急性粒细胞白血病干细胞，发现只有白血病干细胞才具有不断自我更新，维持其恶性显性的作用，首次证明了CSC的客观存在，是人类第一次分离出CSC。
2003年，Al-Hajj等成功分离出人类乳腺癌干细胞，通过连续移植实验，诱导出非肥胖型糖尿病／重症联合免疫缺陷性小鼠（NOD／SCID）的乳腺癌。
2004年，Dirks及Bautch等从中枢神经系统肿瘤中分离出具有干细胞特性的细胞，并在动物实验中得到验证。
2005年，Saad等从前列腺癌组织中成功分离出表型为CD44+／α2β1hi／CD133+的前列腺癌干细胞（约0.1%），其在体外有很高的增殖潜能并形成二次克隆，具有自我更新、无限增殖和分化的能力，在非雄激素依赖下长期存活。
2005年，Kim等从小鼠非小细胞肺癌模型最初阶段分离到支气管肺泡干细胞。
2007年，Li等首次从手术切除标本中分离到CD44+CD24+ESA+胰腺癌干细胞，并通过小鼠的体内成瘤实验证明其成瘤性，组织病理学特点与手术标本类似，证实该干细胞具有高度的自我更新能力。
二、PCSC的理论基础
肿瘤由具有异质性的组织组成，关于肿瘤的异质性有两种解释：一种观点认为异质性起源于不同类型的细胞，即具有干细胞样特性的细胞，这种细胞来源于天然多功能干细胞，还是正常细胞经过突变后转变为干细胞，尚不清楚；另一种观点认为，肿瘤的异质性来自克隆演化，突变的肿瘤细胞生存并繁殖，突变优势细胞群类似干细胞，具有促进肿瘤生长的能力。两种观点并非相互独立，而是具有内在联系。因此，CSC具有两层含义：①肿瘤起源于组织干细胞或胚胎细胞，具有自我更新的调节；②肿瘤是具有干细胞特性的细胞亚群。
（一）PCSC鉴定
目前鉴定方法主要有：细胞表面标志、侧群细胞（side populations，SP）实验、成球生长实验和动物体内致瘤实验。
1.细胞表面标志
主要利用细胞表面带有特异性膜蛋白（即表面标志）的特点，经特异性抗体结合后，用流式细胞仪在荧光活化系统检测下分选出荧光细胞。胰腺癌表面主要分子标志为CD44+CD24+ESA+、CD133+、乙醛脱氢酶1（ALDH1）、c-Met等。Olempska等应用实时定量PCR检测发现，ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）G2在细胞株Panel、Panc89、Colo-357、Panc Tul和A818-6中均显著高表达，而CD133仅高表达于Pane Tul和A818-6细胞株，因此认为ABCG2+／CD133+细胞可能是胰腺癌干细胞，并且通过致瘤实验得到验证。Jimeno等在动物实验中发现胰腺癌部分细胞高表达ALDH1，并且该细胞具有明显的耐药性，表现为CSC的特性。Li等研究表明c-Met介导了胰腺癌干细胞的生长与转移，可作为一种表面标志进行肿瘤细胞的分选。
2.SP细胞实验
PCSC具有ABC转运蛋白功能，能够外排核酸染料Hoechst33342，而大部分非CSC不具备该蛋白。SP细胞实验利用该特性，通过荧光显微镜和流式细胞技术观察具有CSC特性的不着色细胞。Zhou等分离出人胰腺癌细胞株panc-1中的SP细胞，并发现用吉西他滨处理后，SP细胞的比例明显升高，并且该SP细胞具有较高的克隆形成能力和更强的成瘤能力。
3.成球生长实验
PCSC在特定的培养基可形成干细胞球，从而特异富集CSC。针对流式细胞分选出来的CSC的验证，将分选出的CSC进行体外培养，通过悬浮细胞球的生长验证CSC的自我更新和分化能力。细胞生长曲线实验是对分选出的CSC进行体外培养，观察细胞生长指数，并绘制生长曲线，通过对比普通肿瘤细胞的生长速度验证CSC的增殖能力。
4.动物体内致瘤实验
是指用一定数量的待测肿瘤细胞悬液接种至NOD／SCID小鼠体内，观察是否会有肿瘤生成以及肿瘤的发展进程，用以评估待测细胞是否具有形成并维持肿瘤生长及异质性的能力。动物体内致瘤性实验是目前验证CSC的金标准。
（二）PCSCs的表型
2007年，有2个研究报告了不同表型的PCSCs。
Li等将新鲜人胰腺癌标本种植于非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠皮下进行胰腺癌实质细胞的纯化和扩增，再采用荧光激活细胞分选技术发现胰腺癌中存在0.2%～0.8%的CD34+、CD44+、ESA+细胞，该亚群细胞在NOD／SCID小鼠体内表现出高成瘤性，连续传代成瘤。实验发现其致瘤能力及在胰腺癌细胞中的比例保持不变；组织学发现其形成的肿瘤和原发肿瘤类似，两者的胰腺癌分化标志物SLOOP和stratifin也有相同的表达模式。这说明该亚群细胞具有极强的自我更新和分化能力，而且其高表达与干细胞自我更新密切相关的Shh和多梳基因家族Bmi-1，因此该亚群细胞被认为是PCSCs。(https://www.daowen.com)
Hermann等从人胰腺癌组织和人胰腺癌细胞系L3.6pl中分选出CD133+细胞，发现其具备高成瘤、自我更新和多向分化特性。流式分析术发现：CD133+细胞约占人胰腺癌组织中癌细胞总数的1%～3%，在大多数人胰腺癌细胞系中其含量低于1%，并发现CD133+细胞与CD44+CD24+、ESA+细胞之间存在14%的重叠。他们认为，CD133+细胞可能是另一种表型的PCSCs。这一结果验证了Olempska等的推论，他们检测了5株人胰腺癌细胞株的表达，分析认为CD133+和（或）ABCG2阳性可能代表PCSCs。最近，Rasheed等报道，ALDH胰腺癌细胞可能是另一种表型的PCSCs。这种表型的胰腺癌细胞在体外克隆形成能力和体内成瘤能力是未分选胰腺癌细胞和ALDH细胞的5～11倍，其与CD44+和CD24+细胞之间仅存在极少量的重叠。进一步研究发现，ALDH+CD44+CD24+细胞较ALDH-和CD44+CD24+细胞致瘤能力更强，但差异无统计学意义。遗憾的是他们没有研究ALDH与CD细胞之间的关系。
上述研究结果提示，根据目前CSCs的鉴别手段和判定标准，胰腺癌中可能存在不同表型的PCSCs。
三、PCSCs与上皮间质转化
所谓上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮表型细胞在特定生理和病理情况下，向间充质表型细胞转化的现象，几个与胚胎发育相关的转录因子Snail、Slug和Twist等通过抑制Ecad的转录在EMT的诱导中发挥关键作用。
（一）EMT与胰腺癌侵袭转移密切相关
ALDH的表达与人胰腺癌淋巴结、肝和肺的转移密切相关，而ALDH胰腺癌细胞同时具备干细胞特征和间质表型特征。与未分选细胞比，CDH1（其编码产物即E-cad）基因在ALDH细胞中表达下降一半，在ALDH+CD44+CD24+细胞中下降90%；Slug在ALDH细胞中表达增加51倍，而在ALDH+CD44+CD24+细胞中增加73倍。在EMT的诱导中起重要作用的转录因子ZEB1对CSCs“干性”的维持起重要作用。
研究表明：ZEB1敲除后可导致胰腺癌细胞球囊形成能力和成瘤能力下降，侵袭和转移能力也下降，还导致胰腺癌细胞对化疗药物更敏感，干细胞因子Sox2、Bmil和p63表达下调，稳定敲除后CD mRNA表达下调。ZEB1可能通过对微小RNA（miRNAs）的调控来实现对CSCs“干性”的维持。某些miRNAs也参与CSCs“干性”的调控，下调其中起抑制“干性”作用的miRNAs的表达即可以维持干细胞表型。miR-200家族成员（miR-141，miR-200a、b、C和miR-429）的靶基因包括维持胚胎干细胞表型的分子，如Sox2、KLF4和Bmil，因此，其可诱导细胞分化。它们还可以通过抑制ZEB1／2mRNA的转录来抑制EMT的发生，而ZEB1也可以抑制miR-200家族成员的表达，它们之间相互作用形成一个负反馈环。因此，ZEB1可通过抑制miR-200家族成员的表达而在维持“干性”中发挥重要作用。此外，ZEB1还可以通过抑制另一个重要的“干性”抑制因子miR203的表达来维持胰腺癌和结肠癌细胞的肿瘤起始能力，并促进mPCSC的生成。
（二）EMT与胰腺癌治疗抵抗密切相关
Wellner、Shah、Wang等发现吉西他滨耐受的多株胰腺癌细胞系发生了EMT。我们的研究也发现，放化疗抵抗的胰腺癌细胞系富含于细胞样癌细胞，同时其也发生了EMT。有研究表明，吉西他滨耐受的胰腺癌细胞系发生EMT与Notch通路的激活有关，而Notch通路是重要的干细胞信号通路之一。治疗抵抗诱导的EMT与PCSCs之间可能存在密切而复杂的关系。一方面，某些表型的PCSCs本身即可能表现为间质表型，并且PCSCs可能具备更强EMT和间质上皮转化（MET）相互转化的可塑性。如Kabashima等发现，胰腺癌细胞系来源的侧群（SP）细胞具备更强的EMT和MET相互转化的可塑性。
SP细胞被认为是具有干细胞特性的一类细胞。另一方面，在治疗选择压力下，CSCs自我更新受到抑制，放化疗富集PCSCs可能不仅仅是简单的通过杀死敏感的癌细胞来实现，治疗抵抗诱导的EMT可能促进了PCSCs和mPCSCs的产生，分化相对成熟的癌细胞和PCSCs可能通过EMT和MET过程达到动态平衡。两个独立的研究小组在乳腺癌的研究中发现，乳腺癌细胞在经历EMT后获得了与干细胞类似的特征，他们认为诱导EMT促进了乳腺癌干细胞的产生。Vesuna等研究表明，与EMT密切相关的转录因子Twist可以下调CD的表达而促使乳腺癌干细胞的生成。在胰腺癌中，治疗抵抗诱导的EMT是否促进了PCSCs和mPCSCs的生成还有待于深入研究。
四、PCSC相关通路
PCSC与正常细胞一样具有多分化潜能、自我更新能力和信号转导通路，这些通路在胰腺癌干细胞的自我更新和自我调控中起到重要作用。在胰腺癌干细胞中表现得异常激活的通路有音猬因子（sonic hedgehog，Shh）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Notch、骨形态发生蛋白（BMP）、胰十二指肠同源蛋白1（PDX1）和B细胞特异性莫洛尼白血病毒插入位点-1（B-cell-specific moloney murine leukemia virus integration site-1，BMI-1）等。
（一）Shh通路
在人胰腺癌组织中的Shh通路异常激活，胰腺干细胞Shh通路的激活程度是胰腺癌组织的11倍。研究还发现利用转基因技术将Shh基因导入到健康胰腺组织中，可使胰腺组织向胰腺癌前病变方向发展，出现胰腺常见的基因突变类型，如K-ras基因突变、Her2／neu过表达等，利用Shh通路抑制剂环巴胺抑制后，体外胰腺细胞增殖明显抑制。
（二）BMI-1通路
原癌基因BMI-1是转录抑制因子基因polycomb家族成员，它通过调节端粒酶的活性控制细胞的增殖和凋亡。参与正常干细胞调控作用的BMI-1在CSC的维持和自我更新中同样具有重要作用，如乳腺癌、结肠癌等肿瘤中的CSC均明显上调。有学者证实，胰腺癌细胞（CD44+CD24+ESA+）中的BMI-1mRNA具有异常表达，并认为在胰腺癌干细胞中的自我更新的维持上具有重要作用。
（三）Notch信号通路
Notch受体多与相邻细胞间的膜结合配体结合而被激活，是非常保守的信号系统。Notch途径的激活过程是γ-分泌酶作用于Notch受体的细胞内结构域，该结构域从膜上脱落，移位到细胞核调控基因表达，从而影响细胞增殖、分化和转移过程。Notch通路的异常与胰腺癌干细胞的自稳具有明显的相关，其确切关系仍在进一步的研究中。
（四）哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路
mTOR信号通路是新近发现的胞内信号通路，该通路可汇聚和整合来自营养、生长因子、能量和环境压力对细胞的刺激信号，进而通过下游效应器真核细胞始动因子4E结合蛋白1（4EBP1）和核糖体S6蛋白激酶（S6KS）调节细胞生长，并发现该通路与胰腺癌干细胞的自我增殖具有明显的相关性。Mueller等发现，胰腺癌干细胞的mTOR信号通道异常活跃，雷帕霉素是mTOR的抑制物，阻断该信号通道可以抑制部分胰腺癌干细胞（CD133+）的生长。为了更好地杀灭干细胞，研究人员联合应用雷帕霉素、环杷明和吉西他滨（CRG），发现三药联合应用对CSC的杀伤力极强，可以明显延长无瘤生存时间，提示mTOR信号通路积极参与了胰腺癌干细胞的自我更新与分化。
（五）PDX1途径
PDX1是胰腺发育早期起重要作用的启动基因表达的蛋白，在胰腺自我更新时，PDX1可在胰腺导管细胞中短暂表达，在胰腺导管腺癌中高表达，其表达程度又与肿瘤的大小、分化程度以及淋巴结转移等密切相关。并且发现这些特性都与CD133+、CXCR4+的胰腺癌CSC的特性非常吻合。
（六）基质细胞衍生因子1／侵袭前端趋化因子受体-4（SDF-1／CXCR4）轴
SDF-1／CXCR4轴，无论是在胚胎时期胰腺的形成还是损伤胰腺的修复中均具有重要作用，可以促进细胞的增殖和迁移并促进胰管形成。有研究表明在胰腺癌CSC发生转移之前，使用特异性抑制剂（AMD-3100或AMD-070）阻断CXCR4的表达，会明显降低胰腺癌的转移发生率。