8.1.3 研究材料与方法
我们共采集了精神分裂症患者的1 235例血样、重度抑郁症患者1 045例血样和1 235例对照的健康人群的血样。从这些共计3 515例血样中抽提基因组DNA，作为研究材料。采用TaqMan基因分型技术，利用微流体芯片96.96 Dynamic Array在Fluidigm EP1高通量基因分析系统上完成基因分型实验。
（1）研究对象
本研究在1 235例精神分裂症患者（男性805名，女性430名）、1 045例重度抑郁症患者（男性729名，女性316名）和1 235例对照（男性665名，女性570名）中进行的分型。样本详细信息见表8-3。
表8-3 实验样本信息
（2）血样采集与DNA抽提
采集研究对象的外周静脉血样：研究对象的血液由熟练的采血师在无菌条件下抽取约20 mL新鲜血液置放于含有3.5 mL柠檬酸葡萄糖溶液B（ACD）或者EDTA的小管中。血样可以直接抽提基因组DNA，也可以冻存于－70℃超低温冰箱备用。
DNA抽提采用FUJIFILM公司的QuickGene DNA whole blood试剂盒（DB-L）在自动核酸提取系统Quick Gene 610L上完成抽提。
①抽提前试剂的准备：在每瓶EDB中加入溶有的蛋白酶冻干粉的3.3 mL无核酸酶超纯水，在室温下充分混合30 min，混匀后置于4℃保存备用；向每瓶WDB中加无水乙醇160 mL，混匀后置于室温下保存备用；检查裂解液LDB是否有结晶沉淀，若出现结晶，37℃条件下使其溶解后再使用。
②操作步骤：
A.取血样2 mL加入15 mL锥形离心管中。
B.加入300μL EDB和2.5 mL LDB。
C.反复颠倒混匀10次左右，漩涡震荡15 s以上，必须混合彻底。
D.56℃水浴孵育5 min，最大的孵育时间不超过10 min；如使用加热块时，至少需要孵育30 min。
E.加入无水乙醇2.5 mL，反复颠倒混匀10次，漩涡震荡15 s，推荐漩涡震荡速度为2500 rpm，如混合不彻底，将会堵塞Quickgene-610L的洗脱柱，或降低产量。
F.将上述液体转移到Quick Gene 610 L过滤柱中，确保30 min内上机完成滤过过程，运行前检查WDB、EDB确保足量。
G.选择DNA WHOLE BLOOD模式，按开始按钮开始滤过工作。
H.推荐的洗脱体积是500μL，如少于50μL，获得的基因组DNA抽提量将减少，2 mL全血的抽提后获得的DNA量为30～80μg。用另外500μL的洗脱溶液（CDB）再洗脱一次，能够增加10%～20%的洗脱量。洗脱下来的DNA在－20℃长期保存。
③DNA的浓度测定：
使用Nanodrop ND 8000来测定。具体步骤如下：
A.进入Nanodrop ND 8000软件的主界面，点击用来测DNA浓度的Nucleic Acid项。
B.在上样台中间测量孔上滴加纯水1～2μL，点击standard项，取DNA所溶于之液体1μL用作空白对照，选择DNA-50，开始测量。
C.吸取抽提的基因组DNA原液1μL滴于上样台中间测量孔上，输入样品标号，点击Measure，便可快速检测出DNA的浓度及A260／280、A260／230值。一个样品测量完成后，用干净的纸巾吸去样品，继续测量余下所有样品。
D.待所有样品测量结束后，将包含每个测量样品的DNA浓度、A280、A260、A230及A260／280、A260／230的值的结果统一输出到excel表中。
E.样本浓度均一化处理：为了使得样本最终浓度均一化为60 ng／μL，而且在96孔板上每孔为50μL，依照各样本初始浓度，计算应加原液量，并在96孔板上对应好位置，做成excel表，根据表格信息，向每孔中加入需要吸取初始原液的体积，置于37度恒温箱中蒸干水分，再统一向每个孔中加入50μL的超纯水。每块96孔板上可以分装95个样本，右下角的最后一个孔不加样本，用纯净水代替作为空白对照（NTC），用封板膜或铝膜封板，用记号笔标记板号、样本相关重要信息，并做好纸质版或电子版的记录，统一放置于－20℃冰箱备用。
（3）基因分型方法
采用TaqMan分型技术，利用Fluidigm公司的微流体芯片（96.96），在该公司高通量基因分析系统平台EP1上进行基因分型相关工作，见图8-8。
①TaqMan基因分型技术
TaqMan基因分型技术是20世纪90年代罗氏公司发明的一项专利技术，是一种针对SNP的快捷、稳定的分型技术。在分型之前，必须先合成一段TaqMan荧光探针。该探针是一段两端分别标记有一个发荧光基团和一个淬灭荧光基团的寡核苷酸序列。合成的探针由于发光基团和淬灭基团同时存在，发光基团发出的荧光信号刚好被淬灭基团吸收，所以当探针完整的时候是检测不到荧光信号的；当进行PCR时，由于聚合酶Taq酶具有5′外切酶活性，可以酶切结合到模板链上的探针，使发光基团从探针中释放出来，淬灭基团也不会对其发生作用，通过捕获发光信号，进而对应出探针的种类，知道基因型的类别，如图8-7所示。TaqMan基因分型技术简便快捷、稳定可靠，适合大样本量的研究，但是探针价格昂贵，定制周期长。
图8-7 TaqMan分型原理示意图
本次研究采用的CACNA1C基因TaqMan探针的引物信息见表8-4。
表8-4 用来分型CACNA1C基因TaqMan探针的引物信息
②Fluidigm EP1高通量基因分析系统及微流体芯片96.96 Dynamic Array IFC（图8-8）
图8-8 Fluidigm EP1高通量基因分析系统（左）及96.96微流体芯片（右）
Fluidigm公司是集成流体通路的首创造者及全球领先供应商，该公司的微流体芯片和系统可以简便、低成本、高通量地处理一些遗传分析。微流体芯片通过将巨量的流体元件集成于单一微流体芯片，克服了诸多传统实验室系统的局限性。
③基因分型
利用TaqMan基因分型技术，结合Fluidigm公司生产的96.96微流体芯片的Fluidigm EP1高通量基因分析系统上完成基因分型。总体程序如下：
泵油（Prime）：作用是用来关闭微流体芯片内反应室的阀门防止预混的样本和探针见面。
转移（Transfer）：将预混的样本反应混合物加入每个独立的样本阀口，同时将探针混合物加入每个独立的assay阀门口。(https://www.daowen.com)
分配（Load）：将芯片置于IFC Controller上，仪器会自动安排在芯片上的反应位置。
热循环（Thermal Cycle）：将完成load的芯片置于FC1热循环仪上才开始PCR过程。
扫描（Read）：将芯片置于EP1荧光扫描仪上检测荧光信号。
分析（Analyze）：使用SNP基因分型分析软件来查看和分析芯片数据。
具体详细步骤如下：
A.准备Assay（SNP探针）板
取一个96孔板，用来分装assay，提前在excel表格中设计好每个assay在96孔板上的位置，从每根探针的总试剂管中分装出整个实验需要的量，逐个加入96孔板上的对应的孔中，认真仔细，防止加错位置，必要时设一助手帮忙核对与提醒，准确无误地加入后，用封板膜封好后，做好标记，置于－20℃保存。使用时提前拿出融化后，用8通道的电枪上样到Assay Mix板即可使用。
B.准备Assay Mix板
取一个1.5 mL无菌EPP管，做好标记。按照表8-5中一个反应所需成分的量，总共96反应，考虑到加样的损耗，我们实际配置时总反应数目为120个反应。配置好后，震荡混匀，高速瞬时甩一下；分装到一块96孔板的一列共8孔；用8连孔的排枪吸取4.5μL转移到另外一块新做好assay标记的96孔板中；用台式冷冻离心机3 000 rpm离心5 min，使得所有成分都降到底部，用8连孔的电枪，从分装好的探针板中吸取1.5μL的探针加入Assay Mix板中，台式冷冻离心机3 000 rpm离心10 min。
表8-5 Assay Mix反应体系相关信息
C.准备Sample Mix（样本）板
取一个1.5 mL无菌EPP管，做好标记。按照表8-6中一个反应所需成分的量，总共96反应，加上加样时的损耗，实际配置反应数目与assay相同，为120个反应；配置好后，震荡混匀，高速瞬时甩一下，分装到一块96孔板的一列共8孔，用8连孔的排枪吸取3.48μL转移到另外一块新的做好samp le标记的96孔板中；用台式冷冻离心机3 000 rpm离心5 min使得所有成分都降到底部；用8连孔的电枪，从提前准备好的样本96孔板中吸取2.52μL的探针加入Sample Mix板中，用台式冷冻离心机3 000 rpm离心10 min使得所有成分都降到底部。
表8-6 Assay Mix反应体系相关信息
D.Prime Chip：泵油封闭芯片通路管道阀门
取一个96×96 Dynamic Array芯片，打开包装盒，检查弹簧，如没有问题，就开始注入专用密封油。务必将弹簧压到底，再开始注入密封油，必要时可以将芯片一端倾斜一定角度注入，将注射器中的全部密封油注入。同样的方法，注射另一端。将注射完密封油后的芯片放入IFC controller，产品号朝外，运行prime程序，程序将在半小时运行后结束。
E.上样及芯片loading
prime完成后，取出芯片，左上缺角为Assay Mix的第一个位置。用8通道的排枪从Assay Mix和Sam p le Mix各吸取5μL，用8连孔的排枪吸取5μL分别加到芯片的Assay和Samp le室的每个well中，注意避免加样时气泡产生。将chip放回IFC controller，运行load m ix程序，约1.5小时完成后取下芯片。
F.PCR
在做PCR之前，一定要将芯片下发塑料保护膜撕掉，否则整个实验都将因为这么一个小的细节而失败，浪费了时间、试剂及一张芯片。将上完样的芯片置于PCR仪上，打开负压，选择96×96 GTPCR反应程序，反应2～3小时。
a.96×96 PCR反应程序
b.70℃，30 min
c.25℃，5 min
d.52.3℃，10 s
e.50.1℃，1 min 50 s
f.98℃，5 s
g.96℃，9 min 55 s
h.96℃，15 s
i.58.6℃，8 s
n.60.1℃，43 s
从j到m共39个循环，20℃。PCR结束后上机检测，在扫描芯片之前，用公司的胶带粘掉芯片表面灰尘。
G.芯片扫描及数据分析
放入该公司专用扫描荧光信号的仪器中，进行数据读写。使用该公司专用扫描软件来完成扫描过程。
H.数据分析
打开软件，导入数据。数据可以以两种格式存放，一种是该公司软件设定格式，还可以.cas文件的形式导出，便于后继数据统计分析。软件所呈现的分型结果见图8-9。
图8-9 Fluidigm SNP基因分型软件中的一个Taqman探针实验的结果示意图
注：纵坐标是FAM荧光信号，横坐标是VIC荧光信号。原彩图中绿色圆点对应一种纯合子；原彩图中红色圆点对应另外一种纯合子；原彩图中蓝色圆点对应杂合子；原彩图中左下角的黑色点是阴性对照（NTC）；原彩图中有的时候出现灰色的点是未能确定基因型的样品