巨核酶介导的基因组编辑技术

巨核酶也叫作归巢核酸内切酶，是可以识别12～40个核苷酸的一类核酸内切酶。每一种巨核酶对于底物都具有极高的特异性，同时相较于其他核酸酶，巨核酶的毒性较小。所以早在2003年巨核酶就被用于基因组编辑。巨核酶在发挥作用的时候，是通过左右两个单体分别识别DNA序列，然后通过核酸酶酶切活性剪切基因组序列的。巨核酶单体在结构上并不明显区分为DNA结合域结构域和核酸酶酶切结构域。其中来自LAGLIDADG家族的巨核酶是目前研究和应用最多的一类巨核酶。

由于巨核酶对底物的高度特异性识别，所以在选用巨核酶切割基因组的时候，并不能对基因所有位置进行切割。科学家在扩展巨核酶识别位点方面主要通过两种方法来提高巨核酶的应用范围。一是通过工程化的方法对巨核酶进行改造，但是正如之前提到的，巨核酶本身没有明显的DNA结合结构域，所以这对蛋白改造也造成了一些困难。二是通过蛋白结合的方法，将具有可调节识别能力的蛋白序列（例如TAL结构域）与巨核酶结合在一起表达。这样既能达到识别的可选择性，也可以利用巨核酶高效的酶切效率。此外，还可以将以上两种方法结合在一起，产生特异性识别的巨核酶。来自法国的研究小组结合以上两种思路对I-CreI进行改造，获得了超过2000个由I-CreI改造而来的巨核酶。而Precision Biosciences生物技术公司也可以为客户提供识别特定序列的巨核酶。

除了识别DNA序列范围有限之外，另一个影响巨核酶应用的方面是巨核酶的脱靶效应。虽然巨核酶本身的特性决定了它的高度特异性，但是这种对DNA序列的特异性识别是有一定误差的。也就是说，在巨核酶识别的序列中，如果有1～2个错配，巨核酶依旧可以对其进行酶切，只是切割效率相对于完美匹配稍弱一些。所以在选用巨核酶的时候，要同时考虑特异性和脱靶效应。目前巨核酶主要用于农作物的基因组修饰，主要包括玉米、大豆、水稻、棉花等。