锌指核酸酶介导的基因组编辑技术
锌指核酸酶介导的基因组编辑技术，主要是由工程化的锌指核酸酶来实现对于靶序列的切割。该类核酸酶由锌指蛋白和FokI剪切酶组成，在实现基因组编辑的时候，需要左右两个核酸酶共同完成，通常可以识别18个核苷酸序列。锌指蛋白负责对序列的识别。通常一个ZFN由3～4个锌指结构域组成，每个结构域包含大约30个氨基酸，可以识别3个核苷酸。ZFN核酸编辑技术最早在2005年开始被大规模用于基因组编辑技术。
相对于巨核酶的识别局限性，ZFN具有一定的可调控性，可以较广泛地识别基因组DNA序列。这种可调控性，主要通过将识别不同核苷酸的锌指结构域组合在一起来实现。ZFN的不同组合可以用于基因组编辑，接下来将举例说明ZFN的临床相关应用。首先是针对HIV患者进行CCR5缺失突变的基因编辑。HIV病毒主要侵入CD4T细胞，在病毒入侵的过程中，有来自T细胞本身的受体负责与病毒的相关膜蛋白结合，协助HIV病毒进入宿主细胞。CCR5就是其中的一种。人们发现CCR5对HIV病毒入侵具有极其重要的功能，主要是因为一起偶然事件。德国一位患有白血病并携带HIV病毒的患者在经过骨髓移植后，白血病改善，而且体内的HIV病毒也消失。进一步对患者进行分析后，发现他移植的骨髓是携带CCR5-Δ32突变的。而CCR5-Δ32使HIV病毒不能够继续侵入宿主，所以该患者可以保持在未服用其他抗病毒治疗的情况下，两年内未检测到HIV病毒。这一发现证实了CCR5在介导HIV病毒侵入时的重要作用，所以科学家致力于利用基因组编辑技术，对于HIV患者的CD4T细胞进行体外CCR5基因缺失编辑，之后将编辑正确的T细胞再输回患者体内，实现对于HIV的治疗。2014年，针对12名HIV患者的临床研究结果发表在《新英格兰医学杂志》上，结果表明将ZFN编辑过的T细胞再次输回患者体内之后，在治疗期间，患者HIV病毒明显降低。这一技术最终用于临床还需要很多努力，但是ZFN介导的基因组编辑技术确实为疾病治疗提供了新的思路。目前ZFN的临床应用主要用于单一基因造成的疾病，例如针对B型血友病患者凝血因子9缺失的情况，可以用ZFN特异性在基因组某个位置引入该基因，从而治愈疾病。
同时，ZFN的使用也有其局限性。每个锌指结构域负责识别三个核苷酸，所以说即使锌指结构域是可以随机组合的，也并不能够实现对于基因组任意位置的识别和剪切。这一方面同样可以通过基因工程的方法获得更多的锌指结构域来解决，另一方面，ZFN在基因编辑的时候也会出现脱靶效应，也就是说ZFN蛋白对于错误匹配也有一定的容忍度，所以会造成对非靶向位置的剪切。针对这一情况，目前在生物技术上能够做出的技术改进主要包括以下几个方面：一是改变以DNA形式将ZFN转染到细胞的方式，而以蛋白形式直接向细胞导入ZFN。DNA在转染进入细胞后，有一定概率会随机插入宿主基因组，而ZFN的长期表达是造成它脱靶效应的一部分原因。ZFN蛋白本身具有穿透细胞进入细胞的特性，以蛋白形式进入细胞的ZFN在发挥4～6小时的剪切功能之后会被细胞降解掉，所以会减少因ZFN滞留而导致的脱靶效应。二是工程化改造ZFN蛋白的酶切结构域，主要是将FokI酶改造成只能剪切DNA单链的Nickase，这样可以在限制基因组编辑活性的同时减少脱靶效应。