CRISPR／Cas9介导的基因组编辑系统

最后一类核酸酶介导的基因组编辑系统就是由CRISPR／Cas9介导的基因编辑系统。这也是目前使用最为普遍、受到研究者广泛关注的基因组编辑系统。CRISPR／Cas9最开始是在细菌中被发现的，属于细菌用来抵抗外来病毒和质粒入侵的一种自我防御方式。外源病毒或者质粒的一部分DNA序列会被整合到CRISPR的位置，然后被转录为CRISPR RNA（crRNA），这个RNA可以引导Cas9蛋白结合到外源DNA上，并将外源DNA剪切、降解。进一步的研究发现，Cas9蛋白在执行剪切功能的时候，主要识别的是一段被称为PAM的序列。2013年，CRISPR／Cas9基因组编辑系统被优化并被广泛应用。优化的CRISPR／Cas9主要包括一段引导RNA（guide RNA）和Cas9蛋白。这两个成分可以由一个质粒同时表达出来，也可以由两个质粒分别表达出来，目前CRISPR／Cas9载体系统已相对完善。guide RNA主要起到序列识别功能，它是一段与靶位点互补结合的序列，在选择靶点的时候要考虑发生剪切的位点是在PAM位置。Cas9主要实现对于序列的切割。由于guide RNA的选取相对灵活，所以CRISPR／Cas9系统的编辑范围也是比较广泛的。同时，不同DNA序列的编辑只需要改变guide RNA的序列即可实现，所以在价格上也比其他三种核酸酶编辑技术便宜。

目前，CRISPR／Cas9基因组编辑系统在细胞水平和动物水平的应用都相对完善，但是该系统也有一些需要改进的地方，其中最为主要的还是基因组编辑的脱靶效应。目前CRISPR／Cas9的脱靶效应也是影响其临床应用的主要原因。可以将Cas9剪切酶变成只能剪切单链的nickase，也可以以蛋白质形式向细胞导入Cas9蛋白，减少该系统在细胞中的滞留时间。与之相应发展起来的是蛋白的核转染技术，目前从仪器到试剂盒都是比较成熟的。此外，还有研究表明，减少Cas9的用量可以部分降低脱靶效应。科学家也试图通过条件性激活的方法，调控Cas9的剪切活性。