改良加藤厚涂片法
本法对血吸虫卵检查具有定性、定量的优点,也适用于其他肠道蠕虫卵的检查。
(一)器材与试剂
(1)定量板:规格大小30 mm×40 mm×1 mm,中央孔为圆台形,其上底半径3 mm,下底半径4 mm,高1 mm,容积为38.75 mm3,孔中可容粪量41.67 mg。该规格定量板目前使用较为普遍。
(2)刮片:规格大小60 mm×6 mm×2 mm,一端平头,另一端为斜切面,斜切面斜边长8.23 mm。
(3)尼龙绢片:80~100目/25.4 mm,大小为50 mm×50 mm。
(4)亲水性玻璃纸:厚40μm,大小为26 mm×35 mm,使用前在透明液中浸泡24小时以上。
(5)甘油孔雀绿透明液、载玻片、镊子、剪刀、记号笔、标签纸和标本盒等。
(6)甘油孔雀绿透明液配置:100 ml蒸馏水、纯甘油100 ml、3%孔雀绿(或亚甲蓝)1 ml。
(二)操作方法
(1)置尼龙绢片于受检粪样上,用塑料刮片在尼龙绢片上轻刮,粪便细渣即由尼龙绢微孔过滤至绢片表面。
(2)将定量板置于已编号的载玻片中部,用刮片从尼龙绢片上刮取细粪渣填入定量板的中央孔中,填满刮平。
(3)垂直向上移去定量板,粪样即留在载玻片上。
(4)取一张经透明液浸泡的亲水性玻璃纸,抖掉多余的浸泡液后盖在粪便上,用另一块洁净载玻片覆于玻璃纸上轻压,使粪便均匀展开至玻璃纸边缘,形成厚薄一致的圆形粪膜,粪膜直径约2 cm。
(5)用拇指固定亲水性透明玻璃纸,将用来压粪样的载玻片轻轻平移取下,制好的改良加藤厚涂片置于25℃室温,相对湿度75%下过夜透明。(https://www.daowen.com)
(三)显微镜镜检
(1)将透明后的待检标本片置于光学显微镜的载物台上,在低倍镜(10×)下进行镜检,如需进一步鉴别则在40×物镜下观察。
(2)镜检时仔细检查每一视野,并特别注意与未受精蛔虫卵的鉴别。改良加藤法厚涂片透明后,血吸虫卵在镜下呈椭圆形或圆形,无色透明或淡黄色,卵壳薄而均匀,在一定的折光条件下可见到卵内毛蚴轮廓(图5-1 C、D)。
(3)必要时,可对虫卵进行计数。镜下虫卵计数时如有虫卵在视野边缘跨界,按照“数上不数下,数左不数右”的原则进行,记录全片血吸虫卵数。根据计数结果计算每克粪便虫卵数(EPG)。
(四)结果判读
查见血吸虫虫卵则判为阳性。
(五)注意事项
(1)每份粪样至少需做3张涂片,以镜检每片检出虫卵的平均数乘以24即为1克粪便中的虫卵数(EPG)。由于该法取粪量仅为41.67 mg,在每克粪便虫卵数低于20时,易漏检。目前国内血吸虫病流行区的疫情多呈低度流行状态,即居民的感染率和感染度均较低,使用此方法进行个体检查或群体调查时,应注意可能存在的漏检,必要时可采用结合孵化法等其他病原学方法进行平行检测,以提高检出率。
(2)亲水性透明玻璃纸使用前需全部浸入透明液中,浸泡24小时以上,至玻璃纸显示绿色或蓝色。
(3)将刮片上的细粪渣填入定量板时,必须填满中央孔全孔并抹平。压制涂片时应尽量使粪便均匀展开至玻璃纸边缘,但注意避免粪渣溢出。
(4)加藤片的透明时间取决于温度和湿度,一般放置室温过夜即可。冬季温度较低时,则需置25℃温箱内以加快透明。但切忌放置于直射阳光下透明,避免标本片脱水过度,从而影响镜下虫卵的观察。
(5)各地生产的定量板可能规格不一,亦有使用30 mm×40 mm×2.5 mm定量板,板中圆孔的孔径为3.5 mm。为取得准确的虫卵计数,需先核定定量板中孔的粪便量,如每片数得的虫卵数为A,孔内粪便量为Bmg,则换算成每克粪便虫卵数为:A×1 000/B,当粪量为41.67 mg时,则简化为A×24即可。